一种解淀粉芽孢杆菌添加前体物TCA(1,2,4-三氮唑-3-羧甲酰胺)发酵法生产抗病毒药物利巴韦林的生产工艺。本发明首先构建了一个能在解淀粉芽孢杆菌细胞内稳定复制并高效分泌表达嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)的重组质粒pBSA43-Bs816PNP,并将此质粒转化鸟苷生产菌解淀粉芽孢杆菌TA208,得到一株兼具高效生产鸟苷和高效表达嘌呤核苷磷酸化酶这两种特点基因工程菌RBVM(pBSA43-Bs816PNP)。采用该工程菌,以葡萄糖、酵母膏、豆浓、玉米浆、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸亚铁和自来水为原料,添加前体物TCA进行发酵,添加前体物几小时后便可在培养基中检测到较高浓度的利巴韦林。本发明具有发酵周期短,产量高,糖苷转化率高,工艺简便,成本低,能耗低,污染小等优点。
一种解淀粉芽孢杆菌添加前体物TCA(1,2,4‑三氮唑‑3‑羧甲酰胺)发酵法生产抗病毒药物利巴韦林的生产工艺,即利用自行构建的兼具高效生产核苷和高效表达嘌呤核苷磷酸化酶这两种特点的基因工程菌RBVM(pBSA43‑Bs816PNP)通过发酵过程中添加前体物TCA实现发酵法生产利巴韦林,具体工艺包括:A.利用分子生物学技术以鸟苷生产菌解淀粉芽孢杆菌TA208作为宿主菌构建兼具高效表达嘌呤核苷磷酸化酶(PNPase)的基因工程菌RBVM(pBSA43‑Bs816PNP):即利用PCR技术从枯草芽孢杆菌BS168中扩增低分子量嘌呤核苷磷酸化酶编码基因pupG,与经过改造的表达载体pBSA43连接,构建了具有较高表达效率和很高质粒稳定性的分泌型表达载体pBSA43‑Bs816PNP和工程菌RBVM(pBSA43‑Bs816PNP);B.工程菌添加前体物发酵:将步骤A中获得的经扩大培养的菌种RBVM(pBSA43‑Bs816PNP)接入发酵培养基进行工程菌添加前体物发酵,发酵培养基中碳源含量应为8%~12%,氮碳比N:C应介于10:100~15:100之间,无机盐含量应为0.1%~12%,发酵培养基的初始pH7.2~7.8,培养温度33℃~35℃,振荡培养或发酵罐培养60~80h,接种量为5%~10%V/V,发酵过程中,添加氨水调节发酵液的pH值维持在7.0~7.4,发酵开始12‑24h添加TCA。
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