[发明专利]人胰岛素原C肽高产菌株的构建有效
申请号: | 200810167200.0 | 申请日: | 2008-10-08 |
公开(公告)号: | CN101381727A | 公开(公告)日: | 2009-03-11 |
发明(设计)人: | 王福清;郑权;王秀云 | 申请(专利权)人: | 西藏金稞科技有限公司;北京航空航天大学;西藏自治区特色农牧业工程技术研究开发中心 |
主分类号: | C12N15/17 | 分类号: | C12N15/17;C12N15/81;C12N1/19;C12P21/04;C12R1/84 |
代理公司: | 北京安信方达知识产权代理有限公司 | 代理人: | 佟红岩;陶贻丰 |
地址: | 850000西藏*** | 国省代码: | 西藏;54 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 胰岛素 高产 菌株 构建 | ||
技术领域
本发明属于医药领域中的重组多肽药物的生产方法。
背景技术
人胰岛素原C肽是人胰岛素原中A链和B链之间的连接肽,含31个氨基酸,人胰岛素原经酶解形成等摩尔的胰岛素和C肽。胰岛素用于控制糖尿病患者的血糖,C肽曾被认为无临床价值,最新研究证明C肽能够减少糖尿病患者的最严重并发症,如糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病变和糖尿病性神经病变。采用胰岛素与C肽联合用药可有效控制血糖和减少糖尿病并发症的发生。由于人胰岛素原C肽具有巨大的治疗价值和经济价值,现在各国大力开展其生产工艺和临床前研究,目前全世界还没有正式生产上市。
人胰岛素原C肽是一种含31个氨基酸的内源性小肽,生产人胰岛素原C肽主要有三条工艺路线可供选择:化学合成法、生物组织提取法、基因工程法。人胰岛素原C肽含31个氨基酸,用化学合成法生产人胰岛素原C肽存在合成反应步骤多,总收率低,并有价格高昂以及环境污染的弊端,因而化学合成法不可取。虽然人的血液中含有人胰岛素原C肽,但含量极微,从人的血液提取C肽不可能用于大规模生产。
对于人胰岛素原C肽的生产来说,最有效和最直接的解决方法就是利用基因工程的方法,通过构建表达人胰岛素原C肽的基因工程菌株,采用微生物发酵法生产。但由于人胰岛素原C肽是一种小肽,利用基因工程来生产小肽一直是一个难题,最主要体现在:(1)在发酵表达方面,分子量小造成表达量低(与相同摩尔数的大的蛋白质相比),另外,分子量小还容易被宿主细胞降解,从而造成多肽表达量进一步降低;(2)在分离纯化方面,多肽难于分离纯化,收率远低于分子量大的蛋白质;(3)在电泳检测方面,小肽的分子量小容易扩散,用常规的蛋白质电泳不利于检测分析。在这三个难题中,小肽的分析检测可以采用色谱和多肽电泳来弥补;小肽的分离纯化工艺可以 通过不同的纯化方法的优化,其收率一般可控制在30-40%;而难度最大的是如何获得高表达人胰岛素原C肽的工程菌株。
目前,国内外提高C肽表达量的主要方式是将人胰岛素原C肽基因进行串联表达。其基本原理:由于人胰岛素原C肽不含精氨酸和赖氨酸,先可用这两种碱性氨基酸将单拷贝的人胰岛素原C肽基因串联起来表达,然后通过高纯度的胰蛋白酶和羧肽酶B进行双酶切,去除C肽之间的连接氨基酸,释放出天然的人胰岛素原C肽。该方法的优点是可以在大肠杆菌或酵母中获得多聚(个)人胰岛素原C肽串联的融合蛋白的高表达工程菌株,缺点是需要昂贵的双蛋白酶(胰蛋白酶和羧肽酶B)切割,同时增加了分离纯化的步骤以及受双蛋白酶切效率的影响,最终降低了人胰岛素原C肽的产率。该方法已经分别由瑞典创新肽有限公司(中国专利申请公开CN1268141)和上海新药研究开发中心(中国专利申请公开CN1606570)各自申请了专利。
发明内容
本发明目的之一是提供一种胞内高表达人胰岛素原C肽的方法。
本发明的另一目的是提供有关的人工合成的核酸分子、载体和宿主细胞。
本发明采用基因工程的方法,以毕赤酵母为宿主细胞,构建能高效胞内表达人胰岛素原C肽的工程菌株。
该工程菌主要由三个部分构成:毕赤酵母宿主细胞GS115,毕赤酵母胞内表达型载体pPIC3K,一种能够编码人胰岛素原C肽的核酸分子。酵母宿主细胞GS115以及毕赤酵母表达载体pPIC3K均购自美国Introgen Corporation(Carlsbad,CA,USA),能够编码人胰岛素原C肽的核酸分子是人工设计并用化学法合成。
该工程菌的主要特点如下:
(1).宿主细胞:选用的毕赤酵母宿主细胞是GS115,GS115可高密度发酵,因而适合于外源蛋白表达。
(2)表达载体:选用的酵母表达载体是pPIC3K,可有效地胞内表达人胰岛素原C肽。
(3).人胰岛素原C肽的核酸序列:根据人胰岛素原C肽的氨基酸序列,人工设计并化学合成一种能编码人胰岛素原C肽的核酸分子,其序列见SEQ IDNO:1。
本发明研究人员按照本发明工程菌构建方法已经获得高效胞内表达人胰岛素原C肽的工程菌株,并将其2008年10月6日保藏到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏号是No.2686,分类命名为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)。
本发明的实验技术路线:
(1)目的基因的合成
根据人胰岛素原C肽的氨基酸序列,采用化学合成的方法,合成人胰岛素原C肽基因。人胰岛素原C肽含有31个氨基酸,用化学合成法合成人胰岛素原C肽全长基因序列,并在目的基因的两端引入限制性酶切位点。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息,商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于西藏金稞科技有限公司;北京航空航天大学;西藏自治区特色农牧业工程技术研究开发中心,未经西藏金稞科技有限公司;北京航空航天大学;西藏自治区特色农牧业工程技术研究开发中心许可,擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作,请联系【客服】
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