[发明专利]一种结直肠癌类器官的体外培养方法

说明书

本发明公开了一种结直肠癌类器官的体外培养方法包括：1)结直肠癌活检组织预处理：对结直肠癌活检组织进行清洗；剪切后进行酶消化；获得结直肠癌单细胞；2)结直肠癌单细胞体外培养：将所述结直肠癌单细胞与基质胶混合；固化后加入结直肠癌类器官培养液进行培养，获得所述结直肠癌类器官。上述方法简便、稳定、成功率高，所得到的结直肠癌类器官具有三维结构，极大保留了病人肿瘤组织特有的形态学特征，与活检组织的病理学特征高度一致。为建立类器官库和开展药物筛选提供了物质基础。

技术领域

本发明涉及细胞工程领域，具体涉及一种从结直肠癌组织样本在体外培养获得类器官的方法。

背景技术

结直肠癌是人类主要的恶性肿瘤之一，威胁着人类健康。其成病机理研究发现，WNT、RAS-MAPK、PI3K、TP53、TGF等信号通路的异常对结直肠癌的发生有关键作用。除此之外，随着结直肠癌基因组研究的进一步深入发现结直肠癌患者具有微卫星DNA不稳定或者染色体不稳定，与其它癌症相比，结直肠癌具有更多基因异常多样性，患者常具有多基因突变或者多重基因异常。因此，只通过有限样本的分析无法评估治疗方案对患者的广普疗效。

对于结直肠癌的研究与治疗往往都是以来源于病人的细胞系作为对象。细胞系来源于病人，具有癌症患者的遗传信息特征，并能够体现癌症细胞的部分生理特征。但是细胞系在长期培养过程中，由于适应了二维生长的环境，从而丢失了体内原有生理特征和肿瘤的异质性。此外，从结直肠癌病人的肿瘤样本中直接建立细胞系的成功率很低，这大大的限定了所能够获得研究样本的遗传多样性。因此非常有必要建立一种全新的结直肠癌样本体外培养系统，为研究和治疗提供新途径。

在体外利用组织存在的干细胞在适宜条件下可以培养获得三维器官结构，此结构被称为类器官(organoid)。类器官由组织分化而来，与组织细胞含有相同的遗传信息特征。由于其三维结构特质，在体外环境下最大限度保留了体内的生理特性。因此，有需要开发一种简便、稳定、成功率高的结直肠癌类器官的体外培养方法。

发明内容

本发明提供了一种结直肠癌类器官的体外培养方法，在一个具体实施方式中，该方法包括：

结直肠癌活检组织预处理：对结直肠癌活检组织进行清洗；剪切后进行酶消化；获得结直肠癌单细胞；

结直肠癌单细胞体外培养：将结直肠癌单细胞与基质胶混合；固化后加入结直肠癌类器官培养液进行培养，获得结直肠癌类器官。

进一步地，结直肠癌类器官培养液至少包括有丝分裂生长因子、Wnt激动剂、ROCK抑制剂、BMP抑制剂、p38激酶抑制剂；有丝分裂生长因子为EGF、FGF中的一种或两种；Wnt激动剂选自Wnt、Wnt-3a、R-Spondin1-4中的一种或多种；ROCK抑制剂为A8301、Y-27632中的一种或两种；BMP抑制剂为Noggin；p38激酶抑制剂是SB202190。

进一步地，结直肠癌类器官培养液为含有45-55ng/mL EGF、90-110ng/mL Wnt-3a、0.8-1.2μg/ml R-Spondin1、450-550nM A8301、15-25μM Y-27632、45-55ng/mL Noggin、10-15μM SB202190、N2、B27、5-15mM HEPES、1-3mM Glutamax、450-550U/mL青霉素、450-550U/mL链霉素、11-14μg/mL两性霉素、8-12％FBS的DMEM/F12培养液。

优选地，结直肠癌类器官培养液为含有50ng/mL EGF、100ng/mL Wnt-3a、1μg/mlR-Spondin1、500nM A8301、10μM Y-27632、50ng/mL Noggin、10μM SB202190、1X N2、1XB27、10mM HEPES、2mM Glutamax、500U/mL青霉素、500U/mL链霉素、12.5μg/mL两性霉素、10％FBS的DMEM/F12培养液。