[发明专利]预苯酸脱氢酶及其多克隆抗体

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种预苯酸脱氢酶及其多克隆抗体。

背景技术

预苯酸脱氢酶，别名：预沉淀脱氢酶，英文名：prephenate dehydrogenase。预苯酸脱氢酶存在于莽草酸途径中，对合成酪氨酸有重大作用。预苯酸脱氢酶催化预苯酸生成4-羟基苯基丙酮酸，4-羟基苯基丙酮酸通过转氨作用生成L-酪氨酸。L-酪氨酸能够改善记忆和精神警觉性，控制抑郁和焦虑，L-酪氨酸也是黑色素、左旋多巴等多种高价值化合物的原料，被应用于工业生产(参考文献Bonuccelli U，Del Dotto P.New pharmacologic horizons in the treatment of Parkinson disease[J].Neurology,2006.67(7Suppl 2):30-38)。

目前国内外对预苯酸脱氢酶的研究主要集中在Aquifex aeolicus、Streptococcus mutant、Haemophilus influenza以及环境未培养微生物，鲜见对于一些极端微生物比如耐冷，耐热，耐酸，耐碱等微生物中预苯酸脱氢酶的研究。

发明内容

为了解决以上问题，本发明提供一种预苯酸脱氢酶及其多克隆抗体，得到了来源于耐冷微生物中的预苯酸脱氢酶，该预苯酸脱氢酶具有低温酶的特性，而且制备得到预苯酸脱氢酶的多克隆抗体，能够准确检测预苯酸脱氢酶。

本发明的目的之一是提供一种预苯酸脱氢酶的氨基酸序列；所述预苯酸脱氢酶序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的目的之二是提供一种编码预苯酸脱氢酶的氨基酸基因的碱基序列；所述预苯酸脱氢酶的氨基酸基因的碱基序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明的目的之三是提供一种预苯酸脱氢酶的多克隆抗体的制备方法。

预苯酸脱氢酶的多克隆抗体的方法，包括以下步骤：

1)以氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的预苯酸脱氢酶为抗原，免疫小鼠制备抗血清；

2)纯化抗血清得到预苯酸脱氢酶的多克隆抗体。

进一步地，所述预苯酸脱氢酶的制备方法为：

1.1)利用PCR技术扩增SEQ ID NO.2所示的碱基序列；

1.2)将SEQ ID NO.2所示的碱基序列克隆入载体质粒中，构建预苯酸脱氢酶的表达载体；

1.3)将表达载体转化入大肠杆菌感受态菌体中得到重组菌体，依次经扩大培养、诱导表达、收集菌体、破碎菌体和纯化蛋白过程得到预苯酸脱氢酶蛋白。

进一步地，所述纯化抗血清的方法为：将预苯酸脱氢酶蛋白与Ni-NTA偶联制备成抗体纯化层析柱，再将待纯化的抗血清与PBS按照1:1比例混合后经过抗体纯化层析柱，待抗血清中的抗体与预苯酸脱氢酶蛋白结合完全后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，获得纯化的预苯酸脱氢酶的多克隆抗体。

更进一步地，所述步骤1.1)中，PCR技术扩增所用的引物为：正向引物如SEQ ID NO.3所示，反向引物如SEQ ID NO.4所示。

更进一步地，所述步骤1.2)中载体质粒为pET21a(+)。

更进一步地，所述步骤1.3)中，大肠杆菌感受态菌体为大肠杆菌BL21感受态菌体。

更进一步地，所述步骤1.3)中，所述纯化蛋白过程中利用Ni-NTA亲和层析色谱柱进行蛋白纯化。

本发明的优点在于：

1，本发明通过PCR技术在喜冷杆菌属Cryobacterium中扩增得到预苯酸脱氢酶基因，并且通过NCBI Blast碱基序列比对证明该预苯酸脱氢酶基因碱基序列属于喜冷杆菌属的新的预苯酸脱氢酶基因序列。通过基因工程技术得到表达预苯酸脱氢酶蛋白的EcoliBL21-pET21a-PDG重组菌株，诱导表达重组菌株得到预苯酸脱氢酶蛋白，预苯酸脱氢酶为低温酶，即在低温条件下发挥活性，具有较好低温的耐受力。

2，本发明以预苯酸脱氢酶为抗原得到预苯酸脱氢酶的多克隆抗体，该多克隆抗体可以准确地检测预苯酸脱氢酶蛋白。

附图说明

图1为PCR扩增预苯酸脱氢酶基因的琼脂糖凝胶电泳鉴定图；其中M泳道为DNA marker，1号泳道为PCR扩增预苯酸脱氢酶基因的产物；

图2为表达载体pET21a-PDG的构建示意图；

图3为重组菌株Ecoli BL21-pET21a-PDG表达预苯酸脱氢酶蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定图；其中Marker泳道为protein marker；PDG泳道为预苯酸脱氢酶蛋白；