[发明专利]用于食管癌基因甲基化检测的试剂及其试剂盒与应用

说明书

本发明属于生物技术领域，公开了用于食管癌基因甲基化检测的试剂及其试剂盒与应用，具体公开了用于食管癌基因甲基化检测的检测区域。本发明提供的食管癌基因甲基化检测的检测区域，可用于食管癌的早期筛查、进程监测、预后评估的重要检测指标，以DNA甲基化异常作为检测对象，DNA甲基化异常通常发生在癌症早期，并贯穿癌症的发生和发展过程，其甲基化状态一旦形成需要受到外界环境较长时间的持续刺激才会发生改变，因此DNA甲基化区域的检测可以作为食管癌的早期筛查、进程监测、预后评估的重要生物指标。

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及用于食管癌基因甲基化检测的试剂及其试剂盒与应用。

背景技术

食管癌是指从下咽食管起始部到食管胃结合部之间食管上皮来源的癌，主要分为食管鳞状细胞癌、食管腺癌和未分化癌(较少见，恶性程度高)，是最常见的十大恶性肿瘤之一。食管癌早期患者的手术切除率达100％，手术死亡率在2.5％以下，术后5年生存率达92.6％；食管癌的早期症状不明显，若出现进行性吞咽困难，进食后梗噎感、烧灼感、停滞感或饱胀感等症状时，一般属于中晚期阶段而食管癌中晚期患者的术后5年生存率仅30％上下。现阶段食管癌的辅助检查手段主要包括影像学检查(CT、上消化道造影、MRI、PET-CT、超声检查等)、内窥镜检查、肿瘤标志物检查等技术，这些检查技术或检测成本高；或侵入性强；或灵敏度低，不适用于作为食管癌患者早筛的手段。因此迫切需要寻找早期食管癌的生物标志物，开发出灵敏、特异、快捷的检测技术和检测方法，提高食管癌的早期检测率，让更多的食管癌患者在癌症早期发现，给予及时的干预治疗，降低食管癌患者的死亡率。

DNA甲基化可调控细胞增殖、凋亡与分化，是最早被发现、也是研究最深入的表观遗传调控机制之一。DNA甲基化异常与肿瘤的发生是否存在必然性一直是医学界研究的热点之一。目前发现的哺乳动物DNA甲基化的唯一形式就是发生在CpG二核苷酸中胞嘧啶上第5位碳原子的甲基化过程。大多数人类肿瘤组织中都发现有基因甲基化异常，癌细胞中表观遗传编码出现的紊乱也会率先表现在DNA甲基化水平紊乱，且大多数的异常甲基化为抑癌基因的高甲基化，抑癌基因CpG岛的局部高度甲基化往往会导致抑癌基因的转录沉默，会早于癌细胞的恶性增殖，并贯穿癌症的整个发展过程。食管癌的癌变过程是一个多基因变异累积的复杂过程，涉及到多种癌基因和抑癌基因的异常甲基化，因此DNA甲基化指标的检测可以用于肿瘤的早期筛查、诊断、分级以及抗癌药物治疗阶段和预后的疗效监测。

目前DNA甲基化用于肿瘤检测的方法主要分为全基因组甲基化分析和特异位点甲基化检测两大类。全基因组甲基化分析因其检测成本高，经常作为一种高通量筛选发现目标基因的手段。特异位点甲基化检测方法又可以细分为联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA)、甲基化特异性PCR法(MSP)、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析法、甲基化荧光定量法(MethyLight)等。限制性内切酶分析法只能针对已获得特殊酶切位点的甲基化情况，适用范围小；甲基化特异性PCR法基于普通PCR及电泳分析操作繁琐，容易造成样本污染；甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析法需要使用带高分辨率熔解(HRM)模块的荧光定量PCR仪进行检测，对仪器设备要求较高；甲基化荧光定量法基于其较高的通量和敏感性，且无需在PCR后电泳、杂交等操作，减少了样本污染和操作误差，在DNA甲基化的检测中应用较为广泛。但甲基化荧光定量法使用荧光定量PCR时，需要依靠标准曲线或参照基因来测定核酸量，容易产生批内和批间的误差；且对低浓度核酸样本检测的灵敏度不足，容易造成假阴性延误患者病情。与荧光定量PCR相比，数字PCR通过对核酸分子的绝对定量计数，具有更高的检测灵敏度和准确度。数字PCR是将核酸样本进行稀释，遵循泊松分布规律，在微反应单元内高效灵敏地完成目标核酸片段的PCR扩增，获取荧光信号，直接给出靶序列的拷贝数，进行统计学分析，实现了对起始样本的绝对定量，降低了实验结果在批内和批间的误差，提高了检测的灵敏度，可以有效减少假阴性的发生。

基于现有技术所存在的不足，本发明通过筛选食管癌的相关甲基化基因，建立基于数字PCR的食管癌基因甲基化检测方法，期望获取具有更高灵敏度、特异性和准确性的检测试剂，实现对食管癌患者的早期筛查、诊断、分级以及抗癌药物治疗阶段和预后的疗效监测。