[发明专利]载体

说明书

本发明涉及一种正链合成元件、该元件的应用及其在载体中的掺入。

详细地说，本发明涉及能够将一种所需核酸序列(在下文中缩写为“NOI”)——甚至一种以上NOIs——递送至目标部位的一种新型逆转录病毒载体。

此外，本发明还特别涉及一种可有效用于基因治疗的新型逆转录病毒载体。

基因治疗包括：例如，在诸如靶细胞等一种或多种目标部位中进行一种或多种核酸序列的任何添加、取代、缺失、补充、操作等。如果目标部位为靶细胞，则这些细胞可以是组织或器官的一部分。有关基因治疗的一般知识可由《分子生物学》(Ed Robert Meyers，Pub VCH，如第556-558页)中获得。

作为更多实例，基因治疗还可提供一种方法，通过该方法中的任何一种或多种：可使用一种诸如基因等核酸序列来取代或补充一种缺陷基因；可消除一种致病的诸如基因等核酸序列或其表达产物；可添加或引入一种诸如基因等核酸序列或其表达产物用于，例如，创建更有利的表型；可添加或引入一种诸如基因等核酸序列或其表达产物用于，例如，特定目的(即从非转化细胞中进行转化细胞等的挑选)；可从分子水平对细胞进行操作以处理、治疗或预防疾病——如癌症(Schmidt-Wolf and Schmidt-Wolf，1994，Annals of Hematology 69；273-279)或诸如免疫病症、心血管病症、神经性病症、炎性病症或传染性病症等其它疾病；可对抗原进行操作和/或引入以诱导某种免疫应答，如基因接种。

近几年已计划将逆转录病毒用于基因治疗。事实上，逆转录病毒为RNA病毒，其生活周期与裂解病毒不同。由此，逆转录病毒是一种通过DNA中间体进行复制的传染性实体。当逆转录病毒侵染细胞时，其基因组被一种逆转录酶转变成DNA形式。该DNA拷贝可作为模板用于产生新RNA基因组及传染性病毒颗粒组装所需的病毒编码蛋白。

逆转录病毒有许多种，其实例包括：鼠白血病病毒(MLV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、鼠乳腺瘤病毒(MMTV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、Fujinami肉瘤病毒(Fu-SV)、莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBR MSV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、Abelson鼠白血病病毒(A-MLV)、鸟骨髓细胞瘤病病毒-29(MC29)和鸟成红细胞增多病病毒(AEV)。

在Coffin et al(《逆转录病毒》1997 Cold Spring HarbourLaboratory Press Eds：JM Coffin，SM Hughes，HE Varmus pp 758-763)中有逆转录病毒的详细列表。

逆转录病毒科基本上可细分为三个亚科：肿瘤病毒、泡沫病毒和慢病毒。其所有的种类均为通过DNA中间体进行复制的正义RNA病毒。这种由RNA转变为DNA的过程是通过病毒pol基因的蛋白产物来进行的；即依赖于RNA的DNA聚合酶(逆转录酶)和RNase N。该过程的效率取决于病毒内包含的序列元件。这些元件通常包括两个同向重复，即R和tRNA引物结合位点(为第一链合成所需)，以及3’多聚嘌呤序列(3’PPT)(为第二链合成所需)。最近还发现了其它第二链合成元件(迄今仅在慢病毒中发现)；其中包括中央PPT(c-PPT)、中央终止序列(CTS)和U形盒(Llyinskii and Desrosiers 1998)。有关这些元件的功能以及第二链合成的近期综述可参考Coffin et al 1997。

在过去十年中，所有三个亚科的逆转录病毒均经过修饰以用作基因表达载体。这些修饰通常涉及必需病毒基因/序列的缺失以及利用外源启动子和/或特定cDNA将其取代。必需采用这种cDNA取代而不是缺失的原因有两点。首先，与野生型的相比，过大的病毒基因组不会被包装，其次，若没有必需基因，这些基因组将无法进行复制。从安全角度来看，第二点非常重要。因此，为了产生含有这些复制缺陷型基因组的逆转录病毒载体，必须提供反式的缺失基因(通常为gag、pol和env)。这一般可通过使用经设计后由非病毒表达载体表达这些基因的生产细胞来实现。这些生产细胞能够将载体基因组包装在逆转录病毒颗粒中，并且在受体细胞不含有来自，例如，辅助病毒的gag-pol和env的情况下，所得颗粒只能进行一轮的侵染。有关构建逆转录病毒表达载体的近期综述可参考Coffin et al 1997。