[发明专利]反刍动物乳腺上皮细胞的分离纯化法和保存方法

摘要

本发明公开了一种反刍动物乳腺上皮细胞的分离、纯化培养法，包括以下步骤：1)乳腺组织的取样；2)制备培养液；3)组织块培养：得原代培养的乳腺上皮细胞；4)乳腺上皮细胞的纯化：得纯化后的乳腺上皮细胞；5)乳腺上皮细胞的传代培养。本发明还同时提供了一种反刍动物乳腺上皮细胞的保存方法，包括以下步骤：1)制备含反刍动物乳腺上皮细胞的冷冻保护液；2)将上述冷冻保护液逐步慢速降温。采用本发明的方法能延长反刍动物乳腺上皮细胞的保存时间。

主权项

1、一种反刍动物乳腺上皮细胞的分离、纯化培养法，其特征是包括以下步骤：1)、乳腺组织的取样：选用已经与反刍动物相分离的乳腺，将去除结缔组织和脂肪后的乳腺分割成小块组织，并经杀菌和清洗处理后；得体积为0.9～1.1mm3的乳腺组织块，备用；2)、制备培养液：培养液按照下述投料比获得：在每ml的DMEM/F12培养液中添加1μg氢化可的松、5μg转铁蛋白、5μg胰岛素、5μg泌乳素、10ng表皮生长因子、2μmol谷氨酰胺、100IU青链霉素和0.1ml胎牛血清；3)、组织块培养：将步骤1)所得的乳腺组织块放入铺过鼠尾胶原的细胞培养容器内，置37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养3～5h，然后加入培养液于上述条件下继续培养，直至细胞覆盖80％的容器底表面积时，用质量浓度为0.15％胰蛋白酶和0.02％EDTA的消化液于37℃消化悬浮上述贴壁细胞5-8min；直至在倒置显微镜下80-90％细胞回缩、变圆和细胞间隙扩大后，立即用含10％FBS的D-Hanks液终止消化；所得的细胞悬液经过滤和离心，得细胞；用培养液清洗上述细胞3遍；最后用血细胞计数板调整细胞密度，以5×104/mL的密度植入培养板培养，置于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养；培养至细胞覆盖80％板底表面积时，得原代培养的乳腺上皮细胞；4)、乳腺上皮细胞的纯化：将原代培养的乳腺上皮细胞采用差酶法和反复贴壁法，用以纯化上皮细胞；具体如下：差酶法：先用质量浓度为0.25％胰酶的消化液消化成纤维细胞10min，除去成纤维细胞及消化液；再加入质量浓度为0.15％胰酶和0.02％EDTA的混合消化液消化上皮细胞3-5min；反复贴壁法：将得到的上皮细胞经过滤、计数调整细胞密度后，以5×104/mL的密度再种植进细胞培养瓶，置于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养；待细胞铺展到板底80％时，再依次重复上述差酶法和反复贴壁法1～2此，得到预纯化处理后的乳腺上皮细胞；当上述预纯化处理后的乳腺上皮细胞达到80％汇合时，去除培养液；用无Ca2+、Mg2+的Hanks液冲洗细胞，然后加入质量浓度为0.15％胰酶和0.02％EDTA混合消化液，以消化细胞，直至在倒置显微镜下80-90％细胞回缩、变圆和细胞间隙扩大时，用10％FBS的D-Hanks液终止消化；所得的即为纯化后的乳腺上皮细胞；5)、乳腺上皮细胞的传代培养：将上述纯化后的乳腺上皮细胞经离心，得细胞，接着用培养液清洗细胞3遍；去掉上清液，用培养液重新悬浮细胞，并用血细胞板计数调整细胞密度，以5×104/mL的密度植入培养瓶培养，置于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养，隔日换液。