[发明专利]Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒基因拷贝数的绝对定量检测方法在审
| 申请号： | 201410827117.7 | 申请日： | 2014-12-25 |
| 公开（公告）号： | CN104450971A | 公开（公告）日： | 2015-03-25 |
| 发明（设计）人： | 孙强明;黄新伟;席珏敏;赵玉娇;潘玥;陈俊英;王晓丹;李多;邱丽娟;姜黎明 | 申请（专利权）人： | 中国医学科学院医学生物学研究所 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93 |
| 代理公司： | 昆明正原专利商标代理有限公司 53100 | 代理人： | 徐玲菊 |
| 地址： | 650118 *** | 国省代码： | 云南;53 |
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| 摘要： | 本发明提供一种Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒基因拷贝数的绝对定量检测方法，通过Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒的接种培养，再构建Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒标准品质粒，参照所得Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒前膜蛋白区目的基因序列设计下列Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒荧光定量PCR特异性引物，利用所得Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒标准品质粒分别检测病毒培养上清样品或患者血清样品的Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒拷贝数。本发明是针对登革病毒前膜蛋白区域基因构建标准品质粒，建立Ⅱ型及Ⅲ型登革病毒荧光定量PCR绝对定量体系，该检测体系的建立不仅可以对实验体系中的病毒拷贝数进行绝对定量，更为重要的是可以对登革热患者血清中的病毒拷贝数进行绝对定量。 | ||
| 搜索关键词： | 型登革 病毒 基因 拷贝 绝对 定量 检测 方法 | ||
【主权项】：
一种Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒基因拷贝数的绝对定量检测方法，其特征在于经过下列各步骤：（1）Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒的接种培养：按1mL病毒液/瓶的量，将浓度均为4.0MOI/mL的Ⅱ型登革病毒液、Ⅲ型登革病毒液分别接种到生长致密、透明度好的白纹伊蚊C6/36细胞上，于温度为28+2℃、CO2体积浓度为5%的环境中，恒温吸附1小时，于相同环境中，补加病毒液9倍体积的下列病毒维持液：RPMI‑1640培养基 + 2%(w/v)小牛血清 + 0.12%(w/v)的碳酸氢钠溶液，培养至第5天，随后于相同环境中，补加碳酸氢钠溶液直至碳酸氢钠含量为0.12%(w/v)，培养至第8～9天，当白纹伊蚊C6/36细胞病变效应达++++时，收集细胞液，于4℃、3500×g离心分离5min，收获上清液，分别得Ⅱ型、Ⅲ型病毒液；（2）构建Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒标准品质粒：a．根据NCBI数据库中Ⅱ型和Ⅲ型登革病毒标准株序列（GenBank: M29095.1；NC_001475），按下述设计特异性引物：Ⅱ型登革病毒前膜蛋白区域的PCR正、反向引物：DENV‑2For：5'‑AAAAAGGCGAGAAATACGCC‑3'DENV‑2Rev：5'‑CACACAATTCACCAAGGTCCA‑3'Ⅲ型登革病毒前膜蛋白区域的PCR正、反向引物：DENV‑3For：5'‑ACAGTTTCGACTCGG‑3'DENV‑3Rev：5'‑CTTTCATTCTTCCCC‑3'；b．按常规方法分别提取步骤（1）所得Ⅱ型、Ⅲ型病毒液中的登革病毒基因组RNA，再用1U/μl的DNase于42℃下分别处理Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒基因组RNA 3min，以消化残留的DNA，收获的Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒基因组RNA通过RT‑PCR的方法，利用步骤a的特异性引物分别扩增Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒前膜蛋白区域，分别得到对应的扩增产物，再将扩增产物分别连接到pMD‑18T simple克隆载体上，转化DH5α感受态细胞，挑单克隆进行测序鉴定，分别获得Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒前膜蛋白区目的基因序列鉴定正确的阳性菌株；c．将步骤b所得序列鉴定正确的阳性菌株分别进行常规培养，分别获得Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒标准品质粒，并用紫外分光光度计分别测定Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒标准品质粒的浓度，再按下列公式计算标准品质粒的拷贝数：Number of copies（copies/μl） = (Amount×6.022×1023)/（Length×1×109×650）其中，Amount为紫外分光光度计测得标准品质粒所测含量（ng/μl），Length代表模板DNA长度；（3）参照步骤（2）b所得Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒前膜蛋白区目的基因序列设计下列Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒荧光定量PCR特异性引物：D2F：5'‑GCAGGGATACTGAAGAGATGGG‑3'D2R：5'‑TGGTTCTCCGTTACGTGTGG‑3'D3F：5'‑TGGATCACAGTTGGCGAAGA‑3'D3R：5'‑ CCCCCGACTTCTTGAAGGTT‑3'；（4）利用步骤（2）c所得Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒标准品质粒分别检测病毒培养上清样品或患者血清样品的Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒拷贝数，具体检测方法如下：a．将步骤（2）c所得Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒标准品质粒分别用双蒸水按梯度稀释至10‑9，按PCR反应体系以SYBR法实时荧光定量PCR检测标准品质粒扩增效率和特异性，通过荧光定量PCR检测直接获得Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒标准品质粒的扩增曲线与溶解曲线，同时根据荧光定量PCR检测所得标准品Ct值作为X轴，标准品拷贝数log10作为Y轴分别绘制Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒标准品质粒的标准曲线，进而得到Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒标准品质粒的标准曲线方程：所述PCR反应体系如下：表1 荧光定量PCR反应体系（反应总体积为20μl）![]()
采用的反应程序如下：![]()
b．将待测的病毒培养上清样品或患者血清样品，根据需要分别用PBS缓冲液按梯度稀释至10‑5，得到病毒培养上清样品或患者血清样品的梯度稀释液；c．按常规方法提取步骤b所得梯度稀释液中的登革病毒基因组RNA，再用1U/μl的DNase于42℃处理病毒基因组RNA 3min以消化残留的DNA，按下列表2中的条件将病毒RNA逆转录成cDNA：表2 逆转录反应体系：10μl![]()
逆转录反应程序采用：37℃下35min，随后4℃下10min；d．按步骤（4）a提供的PCR反应体系以SYBR法实时荧光定量PCR检测步骤c逆转录反应后的cDNA，分别根据步骤（4）a利用标准品质粒得到标准曲线和标准曲线方程，进而获得病毒上清样品或患者血清样品中登革病毒的拷贝数。
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- 徐进;曾令兵;周勇 - 中国水产科学研究院长江水产研究所
- 2015-04-23 - 2019-10-25 - C12Q1/70
- 本发明公开了一种大鲵虹彩病毒CPA检测引物及应用。一种大鲵虹彩病毒CPA检测试剂盒，包括以下成分：10×ThermoPol®Reaction Buffer；Bst DNA聚合酶；dNTPs；交叉引物CPF、CPR；检测引物DF、DR；剥离引物DPF、DPR；MgSO4；Betaine；核酸检测试纸条。本发明具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点，结果判定客观、直观，且成本低，使用方便，对人和环境都非常安全。本发明不仅可以在专业实验室使用，还可以应用于野外的现场快速检测，仅需一个金属浴或水浴锅，即可在1.5小时内准确检测出样品中的大鲵虹彩病毒。
- NF-κB1基因rs230530 SNP在制备检测丙型肝炎易感性产品中的应用-201711036551.3
- 岳明;黄鹏;张津玮;朱传龙;夏娴;田亭;张云 - 南京医科大学第一附属医院;南京医科大学;南京大学医学院附属鼓楼医院
- 2017-10-30 - 2019-10-25 - C12Q1/70
- 本发明公开了一种人基因组中NF‑κB通路的NF‑κB1基因rs230530单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）或基因型在制备检测或筛查丙型肝炎易感性产品或与丙型肝炎相关的单核苷酸多态性的产品中的应用；在实际应用中，可将检测rs230530的多态性（即等位基因）或基因型物质与其他物质（如检测其它的与丙型肝炎相关的单核苷酸多态性或基因型物质）联合在一起制备筛查丙型肝炎易感者的产品。
- 用三重复合免疫捕获RT-PCR同步检测百合三种病毒的方法-201610210127.5
- 张玉宝;王亚军;谢忠奎;王若愚;郭志鸿;杨果;邱阳 - 中国科学院寒区旱区环境与工程研究所;徐州沐阳生物科技发展有限公司
- 2016-04-07 - 2019-10-25 - C12Q1/70
- 本发明提供了一种免疫捕获三重RT‑PCR同步检测百合隐症病毒、斑驳病毒和黄瓜花叶病毒的方法，其步骤包括在同一个PCR反应管中用LSV、LMoV和CMV的多克隆抗体特异性捕获LSV、LMoV和CMV粒子、利用LSV、LMoV和CMV的特异性引物进行三重反转录聚合酶链式反应RT‑PCR、琼脂糖凝胶电泳检测目的片段；该方法将ELISA和RT‑PCR结合，对现有的免疫捕获RT‑PCR进行了改进，实现了用免疫捕获RT‑PCR同步检测三种百合病毒LSV、LMoV和CMV，从而完善了免疫捕获RT‑PCR技术。
- 基于CRISPR-Cas12a和G四链体-血红素的HBV的检测方法及应用-201910191679.X
- 刘万里;邓敏;邢珊 - 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所）
- 2019-03-14 - 2019-10-25 - C12Q1/70
- 本发明提供一种基于CRISPR‑Cas12a和G四链体‑血红素的HBV的检测方法及应用，过程如下：以HBV患者血清中提取到的DNA为模板，将含扩增引物对、重泡胀缓冲液、ddH2O的RPA反应体系加入冻干酶粉中，再加入MgAc混匀，孵育，得到RPA产物；PS2.M DNA溶解在Tris‑HCL溶液，向溶液中加入Hemin溶液，制得PS2.M/Hemin溶液；将FnCas12a和HBV crRNA加入到Tris‑HCl缓冲液中，孵育，制得Cas12a/crRNA复合物溶液；将RPA产物、PS2.M/Hemin溶液、Cas12a/crRNA复合物溶液孵育，加入ABTS和H2O2处理后测定吸光度。本发明是一种快速、低成本、高准确度、高敏感性和设备简单的检测方法。
- 一种用于检测黄瓜花叶病毒西番莲分离物的引物及其应用-201910525050.4
- 严佳文;解璞;袁启凤;马玉华;王立娟;陈楠 - 贵州省果树科学研究所
- 2019-06-18 - 2019-10-22 - C12Q1/70
- 本发明提供了一种用于检测黄瓜花叶病毒西番莲分离物的引物，所述引物中一对是鉴定黄瓜花叶病毒西番莲分离物的引物CMV‑657F和CMV‑657R，另一对是用于黄瓜花叶病毒西番莲分离物的实时荧光定量RT‑PCR的引物CMV‑174F和CMV‑174R，还提供了应用，用于黄瓜花叶病毒西番莲分离物的定量检测。本发明结合两对引物的定量检测方法灵敏度高、特异性强、检测结果准确，用于西番莲脱毒苗和田间感病植株的早期鉴定和病毒含量定量分析，为西番莲无病毒良种苗木繁育及推广提供技术支撑。该方法能够在4～5小时对样品中的黄瓜花叶病毒西番莲分离物进行准确定量，不仅节约了时间、简化了实验步骤，还有利于在植物发病之前采取相应的补救措施，防止该病毒在作物间广泛传播所带来的巨大经济损失。
- SVA、FMDV、SVDV和VSV的一步法多重实时荧光定量PCR检测引物和探针-201910672178.3
- 王秀明;陈君彦;王玉雯;武瑾贤;魏学峰;刘国英;关平原;范秀丽;张贵刚;王艳杰;刘建奇 - 金宇保灵生物药品有限公司
- 2019-07-24 - 2019-10-22 - C12Q1/70
- 本发明公开了一种SVA、FMDV、SVDV和VSV的一步法多重实时荧光定量PCR检测引物和探针，属于生物技术检测领域。并基于提供的引物和探针开发出了用于同时检测SVA、FMDV、SVDV和VSV的试剂盒。本发明提供的试剂盒和检测方法操作简便、特异性强、敏感性高、重复性好，可以实现对SVA、FMDV、SVDV和VSV同时准确定性和定量检测，将在SVA、FMDV、SVDV和VSV的检测及疫苗生产、例如疫苗生产过程中的质量监控和合理化配苗中发挥重要作用，应用前景广阔。
- 用于检测呼吸道病毒的试剂盒及其应用-201910677694.5
- 卢孟孟;胖铁良;王文轩;马蒙蒙;孙晋华;李建中 - 廊坊诺道中科医学检验实验室有限公司
- 2019-07-25 - 2019-10-22 - C12Q1/70
- 本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种用于检测呼吸道病毒的引物探针组合，包括16对引物及对应的16条探针。本发明还提供了用于检测呼吸道病毒的试剂盒，包括用于检测呼吸道病毒的引物探针组合。本发明还提供了用于检测呼吸道病毒的试剂盒在检测或辅助检测呼吸道病毒中的非诊断目的的应用。应用本发明提供的用于检测呼吸道病毒的试剂盒能同时检测16种呼吸道病毒，实现多重检测，灵敏度高，快捷方便，可实现对样本进行批量检测。
- 新型鹅星状病毒SYBR Green染料法荧光定量PCR检测试剂盒-201910700274.4
- 李宁;刘思当;蔡玉梅;杨玉栋;姜胜男;赵君 - 山东农业大学
- 2019-07-31 - 2019-10-22 - C12Q1/70
- 本发明公开了一种新型鹅星状病毒荧光定量PCR检测试剂盒。所述荧光定量PCR检测试剂盒中含有SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.2所示的引物对，以及标准品质粒和荧光定量PCR反应试剂。本发明的荧光定量PCR试剂盒可以对新型鹅星状病毒进行检测，该试剂盒的特异性强，只与新型鹅星状病毒特异性结合，与其他鹅源病毒都没有交叉反应；而且检测的灵敏度高，在标准品为1×101‑1×107拷贝范围内都有极好的线性关系，可以高效检测新型鹅星状病毒病鹅组织以及无临床症状的病毒携带鹅，提高了检测效率。
- 非洲猪瘟病毒荧光型RAA检测试剂盒-201910773232.3
- 赵林萍;娄亚坤;杨楠;付燕峰;梁小红;任宝红;崔兴涛;曾小宇 - 郑州中道生物技术有限公司;河南中标检测服务有限公司;郑州大学
- 2019-08-21 - 2019-10-22 - C12Q1/70
- 本发明公开了一种非洲猪瘟病毒荧光型RAA检测试剂盒，包括特异性引物ASFV‑F和ASFV‑R，以及RAA‑exo探针ASFV‑P，用四氢呋喃(THF残基)，dT‑荧光团和dT‑淬灭团取代靶标扩增子序列内的碱基，标记的报告荧光染料为FAM，荧光淬灭基团为BHQ‑1，试剂中的核酸外切酶可在THF位点裂解探针，从而分离荧光基团和淬灭基团并产生荧光信号。本发明提供的试剂盒可在37～42℃恒温条件下，20min内实现非洲猪瘟病毒的检测，特异性为100％，检测敏感性为10copies/μl。因此，本发明的试剂盒具有操作简单、快速、灵敏的特点，为非洲猪瘟病毒的现场快速检测筛查提供有效的技术手段。
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