[发明专利]一种毒杀蚊幼虫的双价重组球孢白僵菌及其制备方法

摘要

本发明涉及一种毒杀蚊幼虫的双价重组球孢白僵菌，该重组球孢白僵菌为染色体上重组有蝎毒基因AaIT1和苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因Cyt2Bα的球孢白僵菌，其中，所述的球孢白僵菌为野生型白僵菌GIM3.428菌株，所述的蝎毒基因AaIT1的序列如SEQ NO.2所示，所述的苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因Cyt2Bα的序列如SEQ NO.5所示。本发明所述双价重组球孢白僵菌是将蝎毒基因AaIT1和苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因Cyt2Bα根据球孢白僵菌偏爱密码子优化后导入真菌表达载体pBarGPE1内，再将所构建的重组质粒pBar‑Cyt2Bα‑AaIT1转化到野生型白僵菌GIM3.428菌株内，通过非同源重组整合到其染色体上得到。本发明所述重组球孢白僵菌具有杀灭蚊幼虫效果好的优点。

主权项

1.一种制备毒杀蚊幼虫的双价重组球孢白僵菌的方法，该方法包括以下步骤：(1)依据蝎毒素AaIT1的蛋白质序列应用球孢白僵菌偏爱密码子优化编码DNA序列，得到SEQ NO.2，并在DNA上游按前后顺序分别加上EcoRI酶切位点、绿僵菌Mcl1启动子、信号肽序列，在DNA下游加上XhoI位点,得到蝎毒基因AaIT1的表达框克隆序列；再依据SEQ NO.4所示的苏云金杆菌杀虫晶体蛋白Cyt2Bα的蛋白质序列,应用球孢白僵菌偏爱密码子优化编码DNA序列，并在DNA上游加上BamHI酶切位点、在DNA下游加上EcoRI位点，得到苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因Cyt2Bα的克隆序列；(2)将步骤(1)得到的苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因Cyt2Bα的克隆序列进行PCR扩增，然后将PCR产物与真菌表达载体pBarGPE1分别用BamHI及EcoRI双酶切，凝胶纯化回收酶切产物，用T4DNA连接酶连接，再转化大肠杆菌，并用氨苄抗性筛选出重组菌落，得到重组质粒pBar-Cyt2Bα；(3)将步骤(1)得到的蝎毒基因AaIT1的表达框克隆序列进行PCR扩增,获得PCR产物；(4)步骤(3)得到的PCR产物与步骤(2)得到的pBar-Cyt2Bα重组质粒分别用EcoRI及XhoI双酶切，凝胶纯化回收酶切产物，用T4DNA连接酶连接，再转化大肠杆菌，并用氨苄抗性筛选出重组菌落，得到重组质粒pBar-Cyt2Bα-AaIT1；(5)用步骤(4)得到的重组质粒pBar-Cyt2Bα-AaIT1转染野生型白僵菌GIM3.428菌株的芽生孢子，通过非同源重组，使蝎毒基因AaIT1和苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因Cyt2Bα重组到野生型白僵菌GIM3.428菌株的染色体，并稳定遗传和表达，即得到毒杀蚊幼虫的双价重组球孢白僵菌。