[发明专利]一种将TLR4应用于治疗脓毒症急性肾损伤的研究方法

摘要

一种将TLR4应用于治疗脓毒症急性肾损伤的研究方法，本发明涉及医疗技术领域；小鼠脓毒症性AKI模型的建立；动物成模的判定；标本收集；正常及脓毒症性AKI小鼠肾细胞原代培养；免疫组化(SP法)及半定量测定TLR4；Real‑time PCR检测脓毒症性AKI小鼠原代肾细胞VEGF、sFLT‑1、TNF‑α、TLR4mRNA表达改变；Western‑blot方法检测脓毒症性AKI小鼠原代肾细胞VEGF、sFLT‑1、TNF‑α、TLR4蛋白水平表达改变；构建VEGF基因真核表达质粒以及最佳沉默小鼠VEGF基因ShRNA表达质粒；实验分组；TLR4处理细胞；检测指标；验证TLR4靶向调控VEGF的表达；寻找与VEGF相互作用的蛋白质，探讨VEGF调节TLRs信号通路可能涉及的分子机制。其推测了VEGF与TLR4信号通路交互影响调控脓毒症急性肾损伤具有保护作用。

主权项

1.一种将TLR4应用于治疗脓毒症急性肾损伤的研究方法，其特征在于：它从细胞实验途径进行研究分析，所述的细胞实验的研究方法如下：(1)、小鼠脓毒症性AKI模型的建立：(1.1)、采用单次腹腔注射LPS，10mL/kg，制备脓毒症性AKI的模型；40只Balb/c小鼠按随机数字表法分为2组，即对照组和模型组，每组20只；生理盐水对照组：腹腔给予等量生理盐水；模型组：小鼠腹腔注射10mL/kg的LPS；造模前12h禁食，自由饮水，造模后自由饮水和进食；(2)、动物成模的判定：(2.1)、小鼠激发后的表现：对照组活动灵活，可自由饮水、毛发竖起，活动灵活，可自由饮水、进食，尿量平稳；模型组动物精神萎靡，对外界反应迟钝，呼吸频率加快，被毛蓬松少光泽，大便稀软；12h出现死亡大鼠，随着时间的延长大部分大鼠出现皮温低，肌力减弱，眼周血性分泌物，停止进食进水，排泄稀水样便，色黄，腥臭味；进一步发展出现呼吸急促，对被动仰卧无反抗，排泄物呈黏液状，量多，最终死亡；(2.2)、病理切片：取右肾中叶常规切片HE染色以观察肾脏形态的改变：光镜下找到完整的肾组织横断面，采用image‑pro plus6.0图像分析软件分别测量肾小球体积，肾囊体积，管状结构、肾小管上皮细胞数目；(3)、标本收集：眼球取血后，脱颈处死小鼠，解剖收集小鼠双侧肾脏，剥离多余结缔组织，用生理盐水清洗，滤纸吸干，电子天平称取双肾重；然后，左肾放入4％的多聚甲醛溶液中固定；右肾放入EP管，于液氮中快速冻存，置于‑80℃冰箱中备用；(4)、正常及脓毒症性AKI小鼠肾细胞原代培养：上述各组小鼠麻醉后，开胸迅速取出肾脏置于预先冰浴的D‑hanks'溶液，在解剖显微镜下仔细分离出肾脏，并将肾膜剥离干净，去除脂肪，将获得的肾脏在青霉素小瓶中剪成1mm×1mm的小块后，加入1g/L I型胶原酶，37℃，5％CO2培养箱中消化1h后加入DMEM液，混匀后用金属滤网过滤，滤液置离心管内1000r/min离心6min；弃上清后，沉淀的细胞用含20％FBS、青霉素100U/mL、链霉素100U/mL的DMEM培养液重悬，接种到培养瓶内，让细胞贴壁生长；原代培养的细胞生长约7～10d后融合；0.25％胰蛋白酶消化传代，以含10％FBS、青霉素100U/mL、链霉素100U/mL的DMEM培养液传代培养，每3～4天换液1次，约4～5d细胞长满后传代，3～8代的细胞用于实验；碱性磷酸酶染色为阳性，抗细胞角蛋白抗体反应阳性，鉴定为原代肾细胞；(5)、免疫组化及半定量测定TLR4：肾脏组织经甲醛固定后，常规脱水包埋，并用抗TLR4抗体行免疫组化染色；使用链霉菌抗生物素蛋白‑过氧化物酶连结法进行检测；结果判定为阳性细胞呈棕色，阳性信号为胞浆/胞核内棕黄色颗粒；采用image‑pro plus 6.0图像分析软件测定TLR4含量，以校正后的平均光密度表示；平均光密度为累积光密度除以选定区域的面积；(6)、Real‑time PCR检测脓毒症性AKI小鼠原代肾细胞VEGF、sFLT‑1、TNF‑α、TLR4 mRNA表达改变；(7)、Western‑blot方法检测脓毒症性AKI小鼠原代肾细胞VEGF、sFLT‑1、TNF‑α、TLR4蛋白水平表达改变；(8)、构建VEGF基因真核表达质粒以及最佳沉默小鼠VEGF基因ShRNA表达质粒：构建VEGF基因真核表达质粒以及最佳沉默小鼠VEGF基因ShRNA表达质粒；利用primer 5.0分别设计VEGF的上下游引物，两端分别引入XhoI和EcoRI的酶切位点序列，采用PCR扩增目的基因，并将基因克隆到慢病毒载体表达质粒Lenti‑GFP‑RNAi DNA VECTOR中，构建慢病毒载体表达质粒，酶切、测序验证后，将表达质粒和病毒包装元件质粒pRsv‑REV，pMDlg‑pRRE，pMD2G共同转染到HEK293细胞，获得VEGF基因真核表达质粒以及最佳沉默小鼠VEGF基因ShRNA的重组慢病毒颗粒，取浓缩纯化后的病毒上清感染HEK293细胞，培养48h后收集含慢病毒颗粒的细胞上清液，离心、过滤、分装置－80℃保存备用；(9)、实验分组：取第3～8代培养的正常和脓毒症性AKI小鼠原代肾细胞，0.25％胰蛋白酶消化，台盼蓝染色法计数，细胞存活率大于96％；用含10％FBS的DMEM培养，待细胞90％融合后，换无血清DMEM培养24h，使细胞生长同步于G0期，换用含10％FBS的DMEM液，健康和脓毒症性AKI小鼠原代肾细胞均分为6组：(9.1)、Control 1组：健康/脓毒症性AKI小鼠原代肾细胞，每孔不加任何干预；(9.2)、Control 2组：健康/脓毒症性AKI小鼠原代肾细胞；(9.3)、C34处理组：C34是一种新型特异性的TLR4抑制剂。在培养液中加入终浓度10μmol/L的C34处理，5％CO2温箱中孵育1h；(9.4)、空载体干预组：选择原代培养健康/脓毒症性AKI小鼠原代肾细胞为研究对象，利用慢病毒表达载体转染空载体；(9.5)、VEGF过表达组：选择原代培养健康/脓毒症性AKI小鼠原代肾细胞为研究对象，利用慢病毒表达载体转染，使VEGF过表达；(9.6)、VEGF沉默组：选择原代培养健康/脓毒症性AKI小鼠原代肾细胞为研究对象，利用siRNA干扰，使VEGF沉默；(10)、TLR4处理细胞：分别用1×PBS和TLR4干预各组培养的小鼠原代肾细胞，除Control 1组；每组中分别加入终浓度为：0.1μg/L、1μg/L、5μg/L、10μg/L的TLR4；(11)、检测指标：各组细胞经1×PBS和TLR4干预后，分别于0min、15min、30min、1h、2h、12h、24h，收获并裂解细胞；检测以下指标，并观察小鼠原代肾细胞增殖、凋亡情况：(11.1)、细胞增殖检测：(11.1.1)、流式细胞仪分析小鼠原代肾细胞周期：小鼠原代肾细胞按106个/mL的密度接种于100cm2的培养瓶，培养及分组如前述，收集的小鼠原代肾细胞用PBS液配制成浓度为1×106个/mL的细胞悬液，用预冷的75％乙醇固定，加入RNA酶，碘化丙啶室温孵育后，用FACSort型流式细胞仪Cellquest软件分析细胞周期中各期所占的百分比；(11.1.2)、采用CCK8的检测细胞增殖情况：小鼠原代肾细胞分组处理后，去培养基，每孔加入含10％CCK‑8试剂的培养基，置37℃、5％CO2条件下孵育，于酶标仪上检测，根据OD值计算生长增殖曲线；(11.2)、检测小鼠原代肾细胞凋亡：(11.2.1)、TUNEL检测：采用In Situ Cell Death Detection Kit，POD试剂盒，各组细胞分别接种于6孔板中，37℃含5％CO2的饱和湿度培养箱中培养至50‑70％融合，4％多聚甲醛室温下固定1h，3％H2O2甲醇溶液室温孵育10min，0.1％柠檬酸钠溶液，含0.1％Triton X‑100，室温孵育2min，加入50μl新鲜制备的TUNEL反应液，置湿盒中37℃孵育60min，加入50μl Converter POD溶液，37℃避光孵育30min，DAB染色，苏木素轻度复染，每份样本随机选取5个视野，计算细胞凋亡率；(11.2.2)、流式细胞仪检测：收集培养细胞，加入100μl Binding Buffer和FITC标记的Annexin‑V，20μg/ml，10μl，室温避光30min，再加入PI，50μg/ml，5μl，避光反应5min后，加入400μl Binding Buffer，即进行流式细胞术定量检测；同时以不加AnnexinV‑FITC及PI的细胞悬液作为阴性对照；根据凋亡率分析细胞凋亡情况；(11.3)、Real‑time PCR检测细胞内VEGF、sFLT‑1、TNF‑α、TLR4 mRNA表达改变；(11.4)、Western‑blot方法检测细胞内VEGF、sFLT‑1、TNF‑α、TLR4蛋白水平表达改变；(12)、验证TLR4靶向调控VEGF的表达：(12.1)、通过BLAST等生物信息学方法寻找VEGF在基因组上的定位,采用Mfold软件预测初级转录本的二级结构；通过人类及小鼠转录起始位点预测文库，根据第四位赖氨酸三甲基化的H3组蛋白在TSS位点周围的富集与启动子CpG岛为主要标识，预测VEGF的TSS；运用TFSEARCH转录因子结合位点预测软件分析VEGF的TSS上游2kb内的DNA序列，预测可能的TLR4结合位点；(12.2)、以双荧光素酶报告基因检验TLR4能否通过转录调控VEGF的表达；构建VEGF的启动子报告载体，转染293T细胞；24小时后用TLR4处理转染细胞看，分别加入终浓度为为0.1μg/L、1μg/L、5μg/L、10μg/L的TLR4；于转染48小时后收细胞，并根据Dual‑Luciferase Reporter Assay Kit的使用说明书检测荧光素酶的活性，观察TLR4能否通过转录调控VEGF的表达；(12.3)、通过染色质免疫共沉淀技术，采用TLR4抗体验证TLR4与所预测结合位点的相互关系；(13)、寻找与VEGF相互作用的蛋白质，探讨VEGF调节TLRs信号通路可能涉及的分子机制：(13.1)、应用改良的酵母双杂交系统，以VEGF蛋白为诱饵，进行酵母双杂交试验：(13.1.1)、从小鼠肾组织中提取总RNA，进行cDNA的合成和扩增，将cDNA产物与表达Src的膜定位信号肉豆蔻酰基的基因片段融合，克隆到表达载体上，构建cDNA文库；(13.1.2)、构建诱饵表达载体：诱变pSos上的BglⅡ，NotⅠ位点，同时在MCS上引入一个GFP表达盒；为了与实验室已有的经典酵母双杂交系统的载体兼容，在GFP表达盒两端引入与pDBLEU‑GFP克隆方式相同的酶切位点和同源区；同时确保外源基因与Sos蛋白的C末端相融合；(13.1.3)、将VEGF基因定向克隆至诱饵表达载体，检测无自激活和毒性后，将重组质粒转化酵母温度敏感缺陷株cdc25‑2；(13.1.4)、将含诱饵蛋白VEGF与含DNA文库的质粒共转染转化酵母温度敏感缺陷株cdc25‑2，选择性培养，筛选阳性克隆；(13.1.5)、将阳性菌落中的质粒转化E.coli DH5α，经测序确定能够与VEGF相互作用的靶蛋白/靶基因；(13.2)、将VEGF基因和靶基因分别克隆至腺病毒表达载体pCMV‑Myc和pCMV‑HA，共转染HEK293细胞，用免疫共沉淀的方法验证两者的相互作用；探讨VEGF调节TLRs信号通路可能涉及的分子机制。