[发明专利]一种分离马铃薯晚疫病菌单个卵孢子的方法

摘要

本发明提供一种分离马铃薯晚疫病菌单个卵孢子的方法，利用一定浓度的崩溃酶在适宜的温度下使菌丝与卵孢子分离，再通过多次低速离心的方法去除多余菌丝和孢囊孢子等，最后再将卵孢子悬浮液涂板于水琼脂上，在光学显微镜下观察并利用刀片进行分离单个卵孢子。该方法也适用于卵孢子产生较少的菌株，而且成功率较高，大大节省了操作时间，同时操作难度也大大降低，是病原群体研究试验中快速、大批量分离单个卵孢子的一种行之有效的方法。该方法成功地用于马铃薯晚疫病菌群体遗传试验研究。

主权项

1.一种分离马铃薯晚疫病菌单个卵孢子的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）活化马铃薯晚疫病菌菌株，将菌株接入在黑麦培养基中，置于19℃黑暗条件下培养至15‑18天收集菌丝；（2）称取80‑100mg菌丝于1.5mL的离心管中，加入 1mL的无菌水置于4℃冰箱中低温处理2‑3h，刺激孢子囊释放游动孢子；（3）然后1000r/min，离心2min，去除上清液，加入浓度为30mg/mL的崩溃酶解菌丝、孢子囊和游动孢子，其中崩溃酶是用pH=7.0的PBS缓冲液配置的，并用0.22μm的细菌过滤器过滤；（4）离心1000r/min，1min，去除上清液，加入1mL无菌蒸馏水；依次经过孔径为76μm、40μm 和20μm 的尼龙网过滤，用无菌水冲洗20μm的尼龙网于小烧杯中，收集卵抱子悬浮液；（5）用血球计数板调整卵孢子悬浮液浓度，将卵孢子悬浮液浓度调整到500 个/mL；（6）取1mL卵孢子悬浮液，离心1000r/min，1min，去除750μL上清液，加入1mL无菌蒸馏水，重复步骤3次；（7）将50‑100μL孢子囊悬浮液涂板于水琼脂上，于10×10倍显微镜下镜检，若观测到单个卵孢子，则利用无菌刀片进行分离单个卵孢子，并将含单个卵孢子的水琼脂块移置2mL的离心管中。