[发明专利]一种大肠杆菌质粒DNA的提取方法

摘要

本发明公开了一种大肠杆菌质粒DNA的提取方法，包括以下步骤：（1）纯化培养；（2）扩大培养；（3）预混液的制备；（4）大肠杆菌的裂解；（5）质粒DNA的分离；（6）质粒DNA的收集。本发明提供了一种大肠杆菌质粒DNA的提取方法，整个过程科学合理，提高了单位菌液中质粒的含量和单位质量质粒中超螺旋质粒DNA的含量，并且耗时短，很好的推动了质粒DNA的市场推广应用性。

主权项

1.一种大肠杆菌质粒DNA的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）纯化培养：选取大肠杆菌DH5α菌株，采用平板划线的方法将选取的DH5α菌株接种于含氨苄青霉素的LB固体培养基的平板上，静置20~30min后，将接种后的平板封口后倒置于培养箱内进行培养；（2）扩大培养：待步骤（1）中的平板上长出单菌落，菌落的大小达到0.5~0.6mm时，取出平板，挑取单菌落接种于4~5L含氨苄青霉素的LB液体培养基中，然后将接种后LB液体培养基置于摇床内进行培养，在培养的同时进行光波声波交替处理；（3）预混液的制备：将溶液Ⅰ和溶液Ⅱ按照体积比为1:1.6~2共同投入无菌离心管中，摇匀后置于冰上进行冰浴4~6min，然后量取溶液Ⅰ和溶液Ⅱ总体积45~55%的溶液Ⅲ投入装有将溶液Ⅰ和溶液Ⅱ的无菌离心管中，摇匀后置于冰上进行冰浴2~3min，最后置于4~6℃环境中保存备用，其中预混液的制备过程在稳恒磁场中进行，稳恒磁场的强度为1800~2000Gs；（4）大肠杆菌的裂解：a. 等到步骤（2）中的菌液OD600达到0.9~1时，量取1~2份菌液置于离心管中进行离心处理，离心机的转速为4000~5000rpm，离心后弃去上清；b. 量取0.4~0.5份步骤（3）所得的预混液投入操作a的离心管中，轻轻翻转摇匀后，置于冰上进行冰浴6~7min；（5）质粒DNA的分离：a. 将步骤（4）操作b中所得的混合液置于离心机内进行离心，离心机的转速为4000~5000rpm，离心处理13~17min后，取上清置于新的无菌离心管中；b. 向操作a的新的无菌离心管中加入等体积的异戊醇，摇匀后室温静置8~10min，然后以5000~6000rpm的转速进行离心15~17min后，去上清；（6）质粒DNA的收集：将步骤（5）操作b中得到的沉淀用75%的酒精清洗2~3次后，将沉淀自然风干至含水率为12~16%，然后加入40~50μL TE缓冲液溶解即可。