[发明专利]一种诱导人多能干细胞体外分化为停滞在减数分裂II期的卵母细胞的方法

摘要

本发明公开了一种诱导人多能干细胞体外分化为停滞在减数分裂II期的卵母细胞的方法，该方法分为三步，首先将细胞密度为80％的多能干细胞更换PGC‑m培养基，于35～40℃、3％～6％CO2下培养10天，得原始生殖细胞样细胞；然后将形成的原始生殖细胞样细胞转移至PF‑m培养基中，于35～40℃、8％～12％CO2下培养5天，得卵泡样结构；最后将形成的卵泡样结构转移至OLC‑m培养基中孵育10～15天，得到停止在减数分裂II期的卵母细胞样细胞。采用本发明中的方法，效率高、时间短，而且诱导出的卵母细胞样细胞可排除第一极体，形成次级卵母细胞。该方法为研究人类雌性生殖细胞的形成和卵子发生提供了新的手段。

主权项

1.一种诱导人多能干细胞体外分化为停滞在减数分裂II期的卵母细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)诱导人多能干细胞形成原始生殖细胞样细胞：待无饲养层培养条件下培养的人多能干细胞密度为80～85％时，更换PGC‑m培养基，于35～40℃、3％～6％CO₂条件下培养10天，得原始生殖细胞样细胞，培养过程中每天对培养基进行更换；所述PGC‑m培养基为补充有KSR和bFF的α‑MEM培养基，并且，所述PGC‑m培养基中还添加有如下组分：L‑谷氨酰胺、非必需氨基酸、b‑巯基乙醇、抗生素、骨形态发生蛋白、白细胞抑制因子、干细胞因子、表皮细胞生长因子和ROCK抑制剂；其中，所补充的KSR和bFF均占α‑MEM培养基质量的3～6％，所添加的L‑谷氨酰胺、非必需氨基酸和抗生素均占α‑MEM培养基质量的0.5～2％；所添加的b‑巯基乙醇为0.05～0.15mM；所添加的骨形态发生蛋白、白细胞抑制因子、干细胞因子、表皮细胞生长因子和ROCK抑制剂在培养基中的浓度分别为：40～60ng/mL、150～250ng/mL、80～120ng/mL、40～60ng/mL和5～15μmol/L；(2)诱导原始生殖细胞形成卵泡样结构：将步骤(1)诱导形成的原始生殖细胞转移至PF‑m培养基中，于35～40℃、8％～12％CO₂条件下培养5天，得原始卵泡样结构，培养过程中每天更换一半量的培养基；所述PF‑m培养基以α‑MEM为基础培养基，添加如下组分形成：KSR、bFF、L‑谷氨酰胺、非必需氨基酸、b‑巯基乙醇和抗生素；(3)卵母细胞的体外成熟：将步骤(2)诱导形成的原始卵泡样结构转移至液滴培养基中，用矿物油覆盖，然后置于OLC‑m培养基孵育10～15天，每两天更换一半培养基，得到停滞在减数分裂II期的卵母细胞样细胞；所述OLC‑m培养基以TCM 199为基础培养基，添加如下组分形成：牛血清蛋白、卵泡刺激素、人绒毛膜促性腺激素、孕马血清促性腺激素、丙酮酸钠、表皮生长因子和胰岛素‑转铁蛋白‑硒。