[发明专利]一种响应面法优化蓝刺头总黄酮提取工艺的研究方法

摘要

一种响应面法优化蓝刺头总黄酮提取工艺的研究方法，本发明涉及总黄酮提取工艺研究技术领域，材料的准备；蓝刺头总黄酮的提取与含量测定；单因素试验；响应面优化试验的设计；蓝刺头总黄酮的纯化；数据统计与分析；讨论。其采用超声波辅助提取的方法，在单因素试验的基础上，采用了Box‑behnken中心组合设计，使用响应面分析法对蓝刺头总黄酮超声波辅助提取条件进行优化；通过聚丙酰胺对提取后的黄酮进行纯化，并获得蓝刺头总黄酮的最佳提取工艺和更高纯度的黄酮，为更好地开发蓝刺头的药用价值提供合理的实验依据和参考。

主权项

1.一种响应面法优化蓝刺头总黄酮提取工艺的研究方法，其特征在于：它的操作步骤如下：(1)、材料的准备：(1.1)、材料：蓝刺头采集于鄂尔多斯市达拉特旗，由内蒙古农业大学中兽医教研室鉴定；(1.2)、仪器：电子分析天平BT125D型，超声波仪KQ‑5200B型，UV2000型紫外分光光度计、旋转蒸发仪20L，旋转蒸发仪5L，玻璃层析柱，超纯水一体机，真空干燥箱，真空泵，中空纤维素膜过滤设备；(1.3)、药品：无水乙醇，乙酸乙酯，正丁醇，乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠，瓶装蒸馏水，芦丁；(2)、方法(2.1)蓝刺头总黄酮的提取与含量测定：标准溶液的制备：取芦丁对照品22.8mg，加无水乙醇超声微热溶解，冷却后用水乙醇定无容至100mL，配置成0.21113mg/mL的溶液，备用；最大吸收峰的确定：精确吸取芦丁对照品溶液1mL，放于25mL容量瓶中，置于25mL容量瓶中，各加蒸馏水至6mL，加5％亚硝酸钠溶液1.00mL，摇匀，放置6min，加10％硝酸铝溶液1.00mL，摇匀，放置6min，加氢氧化钠试液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15min；在紫外‑可见分光光度计上扫描波长从200nm～800nm之间的吸光度，结果在波长500nm处有最大吸收值；标准曲线的绘制：分别吸取该对照品溶液1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00mL置于25mL容量瓶中，各加蒸馏水至6mL，加5％亚硝酸钠溶液1.00mL，摇匀，放置6min，加10％硝酸铝溶液1.00mL，摇匀，放置6min，加氢氧化钠试液10mL，再加水至刻度，摇匀，放置15min，在500nm处测吸光度值；测定结果计算得直线方程如下：Y＝11.374x‑0.0095，r＝0.9996，Y为浓度，X为吸光度值；(2.2)、总黄酮得率如下：提取液的总黄酮含量/原药提取重量(2.3)、单因素试验：以蓝刺头总黄酮得率为指标，考察提取溶剂浓度、提取温度、料液比和提取时间各单因素对其得率的影响；研究不同因素对蓝刺头总黄酮得率的影响；(2.4)、响应面优化试验的设计：绘制Box‑Behnken试验设计因素和水平数据表；(2.5)、蓝刺头总黄酮的纯化：蓝刺头醇提物悬浊液25L，经5kDa中空纤维素膜过滤，得到滤液和滤渣两部分，滤渣加水重新混悬，摇匀后重复过滤，滤液合并；滤渣以10L水混悬，以等体积乙酸乙酯萃取3次，合并有机相回收乙酸乙酯；水相继续用等体积水饱和正丁醇萃取3次，合并有机相回收正丁醇，浓缩方法为65℃减压蒸馏，且不断向体系中加入少量去离子水，以降低溶液体系的沸点，浓缩至无正丁醇味；萃取残余水相65℃减压浓缩除去残留的正丁醇，冷却后与前面实验所得的滤液合并，混合均匀待用；用乙醇处理30～80目聚酰胺粉，装填于Φ15cm×100cm玻璃柱中，用去离子水处理至无醇味，柱体积约10L，将上一步所得水溶液上样于聚酰胺柱，用去离子水洗脱60L，弃去水洗部分，换用乙醇洗脱60L，55℃减压浓缩回收乙醇；将两步处理得到的浓缩液充分混合，转移至不锈钢托盘中，60摄氏度真空干燥72h，取出粉碎成粉末状，得到总黄酮；(2.6)、数据统计与分析：采用Design Expert8.0软件对响应面试验得到的数据进行线性回归和方差分析，通过F值考察，P<0.05，模型及因素的显著性，并根据响应曲面图分析出各因素之间交互作用的显著性，以得出科学的实验结果分析；(3)、结果与分析(3.1)、单因素试验结果中乙醇浓度对总黄酮得率的影响：称取原药材粉后加加相应浓度的乙醇溶液50mL后，密封，同时在80W超声波仪中温度50℃，超声1h后，冷却，用相应浓度乙醇补足减失的重量；各取滤液5mL至25mL容量瓶中，以标准曲线建立方法，自“各加蒸馏水至6mL”起，按步骤(2.1)中方法测定，计算总黄酮的得率，并绘制线性图；根据线性图可知，一定范围内随着乙醇浓度的升高，蓝刺头总黄酮的得率也随之升高，当乙醇浓度为70％时黄酮得率最高，随后随着乙醇浓度升高，黄酮得率反而出现下降趋势；因此，选择60％、70％、80％的乙醇浓度进行响应面分析；(3.2)、单因素试验结果中提取时间对蓝刺头总黄酮得率的影响：绘制提取时间对蓝刺头总黄酮得率的影的线性图，根据线性图可知，当超声提取时间小于90min时，蓝刺头总黄酮得率随着超声提取时间延长而缓慢逐渐增大，当超声提取时间大于90min时，得率又出现略微下降的趋势，超声提取时间为90min是最适提取时间；因此，选择60min、90min、120min的提取时间进行响应面分析；(3.3)、单因素试验结果中料液比对蓝刺头总黄酮得率的影响绘制不同料液比对蓝刺头总黄酮得率的影响的线性图，由线性图可知，在一定料液比范围内，随着的料液比的增大，蓝刺头总黄酮得率也随之升高，当料液比达到1:40时，蓝刺头总黄酮得率达到拐点，随着料液比的继续增加，总黄酮得率反而减小，因此综合考虑，选择1:30、1:40、1:50的料液比进行响应面分析；(3.4)、单因素试验结果中提取温度对蓝刺头总黄酮得率的影响绘制提取温度对蓝刺头总黄酮得率的影响的线性图，由线性图可知，随着超声温度的增加，蓝刺头总黄酮得率也随之逐渐升高，温度升高到60℃时，总黄酮得率达到最大值，为5.76％，然后随着提取温度的继续上升，总黄酮得率反而出现下降趋势；因此，选择50℃、60℃、70℃的提取温度进行响应面分析；(3.5)、响应面优化试验中二次响应面回归模型的建立与分析：建立响应面法实验设计与结果数据表；(3.6)、响应面优化试验中乙醇浓度和提取时间的交互作用对蓝刺头总黄酮得率的影响：绘制乙醇浓度与提取时间对总黄酮得率的影响的曲面图和等高线图，由曲面图和等高线图可知，乙醇浓度和提取时间的交互作用下，得率可以达到5.4％‑5.6％，此时的乙醇浓度为80％，提取时间为120min；根据曲面图，增加乙醇浓度，得率依然有提高的可能性，因此在优化实验方案时，可以将乙醇浓度提高的100％；相反，增加提取时间，总黄酮得率并没有提高；(3.7)、响应面优化试验中乙醇浓度和料液比的交互作用对蓝刺头总黄酮得率的影响：绘制乙醇浓度与料液比对总黄酮得率的影响的曲面图和等高线图，该曲面图和等高线图表示乙醇浓度和提取时间的交互作用下，得率为5.4％左右，此时的乙醇浓度为80％，料液比为1:50，根据等高线图可以发现乙醇浓度对得率的影响要高于料液比，同时显示增加乙醇浓度，得率依然有提高的可能性；增加料液比，黄酮得率没有增加的趋势；(3.8)、响应面优化试验中乙醇浓度和温度的交互作用对蓝刺头总黄酮得率的影响：绘制乙醇浓度与提取温度对总黄酮得率的影响的曲面图和等高线图，该曲面图和等高线图表示乙醇浓度和提取温度的交互作用下，乙醇浓度和提取温度的交互作用下，得率在5.0％‑5.2％范围，等高线图显示增加乙醇浓度，得率依然有提高的可能性，但是温度过高或者过低均不利于得率的提高，最佳温度范围在55‑65℃；(3.9)、响应面优化试验中提取时间和料液比的交互作用对蓝刺头总黄酮得率的影响绘制提取时间与料液比对总黄酮得率的影响的曲面图和等高线图，其中曲面图较为平缓，说明料液比和提取时间的交互作用对得率的影响不大，料液比的影响要高于提取时间，但是增加料液比，黄酮得率的增加量较为缓慢；(3.10)、响应面优化试验中提取时间和温度的交互作用对蓝刺头总黄酮得率的影响：绘制提取时间与温度对总黄酮得率的影响的曲面图和等高线图，该曲面图和等高线图显示，提取时间与温度对总黄酮得率的影响，温度的影响要高于提取时间，温度在55‑60℃范围，得率较高，在4.8％‑5.2％范围；(3.11)、响应面优化试验中料液比和温度的交互作用对蓝刺头总黄酮得率的影响：绘制料液比与提取温度对总黄酮得率的影响的曲面图和等高线图，该曲面图和等高线图显示，料液比与提取温度对总黄酮得率的影响，提取温度要高于料液比的影响，提高料液比对得率的影响不大，而温度在55‑60℃范围，得率较高，在4.8％‑5.2％范围；上述分析得出，对总黄酮得率的影响：乙醇浓度>温度>料液比>时间，其中乙醇浓度和提取温度对总黄酮的得率影响较大，而增加料液比或者提取时间，对总黄酮的影响较小，因此在优化提取方案时，可将乙醇浓度设置在60％‑100％、提取时间为60‑120min、料液比为1:30‑1:50、提取温度为55‑70℃；实验得率取最高值，设置范围为4.5％‑100％，此时优化的提取方案为乙醇浓度100％、提取时间为120min、料液比为1:50、提取温度为65.4℃；实验得率为7.18％；(3.12)、最佳工艺条件的预测和检验模型建立的回归方程为：得率＝10.376‑0.18×X1‑0.068×X2‑0.11×X3+0.18×X4+8.58×10‑4×X1×X2+9.25×10‑4×X1×X3+2.00×10‑4×X1×X4‑7.50×10‑5×X2×X3+1.42×10‑4×X2×X4+4.50×10‑4×X3×X4+5.10×10‑4×X12+1.36×10‑5×X22+4.60×10‑4×X32‑1.80×10‑3×X42，R2＝0.7468，其中X3为料液比中液体部分的数值；根据回归方程得到的预测值与真实值相比较，残差大多数在0～5％之内，说明模型的预测结果良好；(3.13)、蓝刺头总黄酮的纯化的标准曲线绘制：精密称定5mg芦丁，置于25ml容量瓶，加入75％乙醇溶解至刻度，配成0.2mg/mL芦丁标液；精密量取标品0mL、0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL置于10mL量瓶中，加5％亚硝酸钠0.3mL，静置6min，再加10％硝酸铝0.3mL，静置6min，最后加4％氢氧化钠4mL，并加入75％乙醇至刻度摇匀，静置15min；紫外510nm处读取吸光度，浓度为X轴，吸光度为Y轴，绘制标准曲线，该标准曲线中，在0.01～0.08范围内线性关系良好；(3.14)、蓝刺头总黄酮的纯化的样品测试：平行称取一定量的待测样品三份，溶解于75％乙醇水溶液，定容至10mL，稀释25倍，按照上述方法测试吸光度，取三组数据的平均值，总黄酮含量为84.8％；(4)、讨论从曲面图上可以得出得率的最高值，从得率最高值可以分别得出每个因素的取值范围，以方便进一步优化实验方案；乙醇浓度和提取时间的交互作用下，得率可以达到5.4％‑5.6％，此时的乙醇浓度为80％，提取时间为120min；根据曲面图，增加乙醇浓度，得率依然有提高的可能性，因此在优化实验方案时，可以将乙醇浓度提高的100％；乙醇浓度和料液比的交互作用下，得率为5.4％左右，此时的乙醇浓度为80％，料液比为1:50，根据等高线图可以发现乙醇浓度对得率的影响要高于料液比；同时显示增加乙醇浓度，得率依然有提高的可能性；乙醇浓度和提取温度的交互作用下，得率在5.0％‑5.2％范围，登高线图显示乙增加乙醇浓度，得率依然有提高的可能性，但是温度过高或者过低均不利于得率的提高，最佳温度范围在55～65℃；料液比和提取时间的交互作用对得率的影响不大；提高料液比和提取时间对得率的影响不大，而温度在55～60℃范围，得率较高，在4.8％‑5.2％范围；因此在优化提取方案时，可将乙醇浓度设置在60％～100％、提取时间为60～120min、料液比为1:30～1:50、提取温度为55～70℃；实验得率取最高值，设置范围为4.5％～8％，此时优化的提取方案为乙醇浓度100％、提取时间为120min、料液比为1:50、提取温度为65℃，实验得率为7.18％；同时得到蓝刺头总黄酮得率与各提取条件的二次多项式模型，该模型拟合度较好，在实际应用过程中具有一定的参考价值。