[发明专利]一种从浓香型大曲中分离纯化酯化酶的方法在审
申请号: | 201911017251.X | 申请日: | 2019-10-24 |
公开(公告)号: | CN110628744A | 公开(公告)日: | 2019-12-31 |
发明(设计)人: | 曹新志;任林生;肖梦月;钟利明 | 申请(专利权)人: | 宜宾五粮液股份有限公司;四川轻化工大学 |
主分类号: | C12N9/20 | 分类号: | C12N9/20;C12N9/16;C12N9/14 |
代理公司: | 51229 成都正华专利代理事务所(普通合伙) | 代理人: | 李蕊;郭艳艳 |
地址: | 644007 四川*** | 国省代码: | 四川;51 |
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摘要: | 本发明公开了一种从浓香型大曲中分离纯化酯化酶的方法,以浓香型大曲为试验材料,用DEAE纤维素DE‑52离子交换层析和葡聚糖G‑100凝胶层析相结合的方法对大曲中的酯化酶进行了分离纯化。本发明产物通过SDS‑PAGE检验其纯度时显示为两条主要的条带,分子量分别为37.2kD和30.8kD,经过四步纯化后,酯化酶被纯化了3.49倍,酶活回收率为28.01%。 | ||
搜索关键词: | 酯化酶 浓香型大曲 分离纯化 大曲 离子交换层析 发明产物 凝胶层析 试验材料 葡聚糖 酶活 条带 回收率 检验 | ||
【主权项】:
1.一种从浓香型大曲中分离纯化酯化酶的方法,其特征在于,包括以下步骤:/nS1.将浓香型大曲粉碎,然后过40目筛,得到大曲粉;/nS2.将步骤S1所得大曲粉置于浓度为0.2-0.4mol/L、pH6的NaCl溶液中,于3-5℃温度下浸泡1-2h,过滤得到滤液;/nS3.将步骤S2所得滤液在3-5℃搅拌,加入硫酸铵,使溶液饱和度达到25-35%,搅拌15-30min,置于3-5℃温度下沉淀1.5-2.5h后,冷冻离心13-15min,取上清液,再加入硫酸铵使溶液饱和度达到75-85%,搅拌待硫酸铵全部溶解后再搅拌15min,搅拌15-30min,置于3-5℃温度下沉淀1.5-2.5h后,冷冻离心16-25min,取沉淀加入pH=8.5的Tris-HCl缓冲液复溶,再于3-5℃下离心去除沉淀,得到粗酶液A;/nS4.将步骤S3所得粗酶液A在3-5℃搅拌,加入体积为粗酶液A 3-4倍的-20℃预冷的丙酮,于-20℃放置过夜,然后冷冻离心13-15min,弃上清液,对沉淀清洗除杂后,用pH=8.5的Tris-HCl缓冲液复溶,再于3-5℃下离心去除沉淀,得到粗酶液B;/nS5.用0.02mol/L、pH=8.5Tris-HCl缓冲液平衡DEAE纤维素DE-52离子交换层析柱,将步骤S4所得粗酶液B经0.45μm微孔滤膜过滤后进行梯度洗脱,得浓缩液;/nS6.将葡聚糖G-100凝胶加水煮沸2h,静置沉降后,弃去上层液,作为填料装柱,通过2-3倍柱床体积的0.02mol/L、pH=8.5Tris-HCl缓冲液作为洗脱液使柱床稳定,将步骤S5所得浓缩液经0.45μm微孔滤膜过滤后进行洗脱,即得。/n
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