一种芍药成熟种胚的石蜡切片制作方法
专利号(申请号):201310636143.7
专利类型:发明专利
更新时间:2018-05-21 09:40:43
项目编号:71039
所属行业:生物医药
交费状态:交费已下证
参考价:50000 元含 国家官方手续费、平台服务费
关键词: 一种 芍药 成熟 石蜡 切片 制作方法
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专利详情

【摘要】:

发明公开了一种芍药成熟种胚的石蜡切片制作方法,其步骤是取材与固定:剥去种皮,切割种子,将含种胚和部分胚乳的种尖部分浸入FAA固定液中固定24h以上;脱水:浓度70%乙醇中泡洗3~5次后从浓度70%乙醇开始梯度脱水;透明:二甲苯作透明剂进行5级透明;浸蜡与包埋:倒出1/2体积二甲苯,向瓶中加蜡屑至饱和,40℃过夜。之后每隔2h换一次蜡液,每天3次,重复3天后进行常规石蜡包埋;切片;展片及粘片:在50℃恒温水浴锅的铁板上使蜡带展平;脱蜡、复水、番红固绿染色、透明;封片。本发明能够得到组织结构完整、清晰的芍药成熟种胚石蜡切片,从而为研究芍药种子休眠和萌发提供准确的技术支持。

【主权项】:

一种芍药成熟种胚的石蜡切片制作方法,其特征是:包括如下步骤:(1)取材和固定:a. 洗种子:用洗洁精清洗10~20min,流水冲洗干净;b. 种子的筛选:水选,浸种2~3h之后,去除上浮的不充实种子;c. 用浓度0.5%的高锰酸钾溶液对芍药种子进行40min消毒处理,用蒸馏水冲洗干净;d. 在恒温箱中,45℃温水浸种48h,使种皮软化,种子吸水;e. 去除上浮的不充实种子;f. 用吸水纸吸干种子表面的水分,用手术刀剥去种皮,将芍药种子切割成含有胚的种尖部分,迅速放入盛FAA固定液的青霉素药瓶中固定,4℃冰箱放置,固定24h以上;(2)脱水:将固定好的材料放入浓度70%的乙醇中泡洗3~5次,先后转入浓度70%乙醇、浓度80%乙醇、浓度90%乙醇、浓度95%乙醇进行梯度脱水,各梯度间隔时间为1.5h。之后无水乙醇浸泡1h,然后更换无水乙醇再浸泡1h,对材料彻底脱水;(3)透明:脱水后的芍药成熟种胚依次入体积比为2:1的无水乙醇和二甲苯混合液、体积比为1:1的无水乙醇和二甲苯混合液、体积比为1:2的无水乙醇和二甲苯混合液浸泡,各级浸泡透明2h,然后更换纯二甲苯浸泡1h,再次更换纯二甲苯浸泡30min;(4)浸蜡和包埋:透明处理后将青霉素瓶中的二甲苯倒出1/2,向瓶中添加蜡屑,直到饱和,放回恒温箱中,40℃过夜,青霉素瓶盖儿漏缝盖,让二甲苯慢慢蒸发;第二天早上,再向小瓶中加1/5药瓶体积的蜡屑,敞口放置于60℃恒温箱中,2h后把原溶液倾去,换熔融石蜡,熔点为52~54℃和62~64℃的混合蜡液,两者体积比1:1之后每2h换一次蜡液,每天3次,重复5天后进行常规石蜡包埋;(5)切片:根据材料在蜡块中的位置和方向,将蜡块修成梯形,然后粘到切片机的蜡台上进行切片,采用旋转式手动切片机,切片厚度7~10μm;(6)展片及粘片:在洁净的载玻片上均匀涂上明胶,将蜡带光面小心地放在载玻片上,以水作漂浮剂,在50℃恒温水浴锅的铁板上使蜡带展平,之后自然干燥;(7)脱蜡、复水、番红固绿染色、透明:将充分干燥的切片放入二甲苯中浸泡30min,之后换新的二甲苯再浸泡20min进行脱蜡;脱蜡后的切片依次放入体积比为1:1的无水乙醇和二甲苯混合液、无水乙醇及浓度95%、80%、70%、50%乙醇中各5min,于蒸馏水中浸洗2次;之后用浓度1%的番红进行过夜染色。番红染色后的切片经蒸馏水浸洗2遍后依次入浓度50%、70%、80%和95%乙醇中各5min进行脱水处理;之后用浓度0.5%的固绿染色30s,经两次无水乙醇透明,每次5min;切片依次入体积比为1:1的无水乙醇和二甲苯混合液5min,二甲苯5min,二甲苯5min进行透明处理;(8)封片:切片从二甲苯中取出,待二甲苯未挥发完全之前,在材料中央滴1滴中性加拿大树胶,将盖玻片一侧放置在滴有树胶的组织切片上,慢慢放下盖玻片并将空气完全排除;封好的切片放入40℃恒温箱中干燥过夜,制成永久切片。

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