[发明专利]一种区别牛病毒性腹泻病毒1型和2型RT-PCR-RFLP方法

说明书

技术领域

本发明属于动物传染病学技术领域，涉及一种区别牛病毒性腹泻病毒1型和2型 RT-PCR-RFLP方法，具体涉及一种利用牛病毒性腹泻病毒1型和牛病毒性腹泻病毒2型的5’ 端基因序列酶切位点差异来区分牛病毒性腹泻病毒1型和牛病毒性腹泻病毒2型的逆转录 （RT，reversetranscription）-聚合酶链式反应(PCR，polymerasechainreaction)—限 制性片段长度多态性（RFLP，restrictionfragmentlengthpolymorphism）方法。

背景技术

牛病毒性腹泻病毒（Bovineviraldiarrheavirus，BVDV）属于黄病毒科瘟病毒 属成员，可引起牛病毒性腹泻/粘膜病。该病除可感染牛（尤其是犊牛）外，还见有感染猪、羊 和鹿等动物。

当前，牛病毒性腹泻病毒分为2个基因型：基因1型和基因2型。基因1型牛病毒性腹 泻病毒感染的主要症状为一过性发热、腹泻和急慢性粘膜病。基因2型引起的症状主要表现 为发烧、腹泻、呼吸失调和血小板减少等，主要导致奶牛流产，对牛的致死性较高。

当前，基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒在我国均见有报道，急需一种快速鉴 别诊断方法来区分牛群中的基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒感染。目前，BVDV的病原 诊断主要有病毒分离、血清中和、ELISA及PCR方法等。当前，检测基因1型和基因2型牛病毒 性腹泻病毒的PCR已见有研究报道，但使用的引物一般在两组（4条）及以上，分别针对基因1 型和基因2型牛病毒性腹泻病毒的基因组特征来设计。

本发明通过分析比较基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒的基因组特征，建立一 种可用于基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒的鉴别诊断方法。该方法仅需一组特异性引 物对基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒的核酸RNA进行RT-PCR扩增，通过基因1型和基因 2型牛病毒性腹泻病毒RT-PCR扩增产物中酶切位点的差异进行酶切鉴定，建立区分基因1型 和基因2型牛病毒性腹泻病毒的RT-PCR-RFLP鉴别诊断方法。

目前，国内外尚无有关利用RT-PCR-RFLP方法来区分基因1型和基因2型牛病毒性 腹泻病毒的报道，本发明填补该领域的空白。

发明内容

本发明的目的是提供一种区别牛病毒性腹泻病毒1型和2型RT-PCR-RFLP方法，根 据基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒全基因序列5’末端序列的特征，设计一组（2条）引 物可同时对基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒进行RT-PCR扩增。在基因1型和基因2型牛 病毒性腹泻病毒RT-PCR扩增中，基因1型牛病毒性腹泻病毒中含有PstⅠ酶（酶切位点序列为 CTGCAG），而基因2型牛病毒性腹泻病毒中没有该酶切位点，通过对RT-PCR产物的PstⅠ酶切 来建立基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒快速鉴别诊断的RT-PCR-RFLP方法。

本发明采用以下技术方案：

一种区别基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒的RT-PCR-RFLP方法，包括以下步骤：

（1）提取基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒基因核酸RNA；

（2）用引物BVDV-12F和BVDV-12R同时对基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒进行RT- PCR扩增，得到相应的RT-PCR扩增片段；

（3）取RT-PCR扩增片段产物进行经PstⅠ酶切分析。

其中，RT-PCR扩增引物（BVDV-12F和BVDV-12R）需满足如下要求：

①该组RT-PCR扩增引物区需根据基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒基因组保守区 设计，可同时对基因1型和基因2型牛病毒性腹泻病毒进行阳性RT-PCR扩增，目的片段大小 为335bp。

②该组RT-PCR扩增引物（BVDV-12F和BVDV-12R）扩增基因1型和基因2型牛病毒性 腹泻病毒的片段中，仅基因1型牛病毒性腹泻病毒扩增产物中含有PstⅠ酶切位点，可被切成 2段（236bp和99bp），而基因2型牛病毒性腹泻病毒扩增产物中没有PstⅠ酶切位点，被PstⅠ酶 切后大小不变，仍为335bp。

根据以上要求，所述的步骤（2）的扩增引物BVDV-12F和BVDV-12R的序列为：

上游引物BVDV-12F：5’-GCTAGCCATGCCCTTAGTA-3’，