[发明专利]一个龙胆酸双加氧酶及其编码基因和应用

说明书

本发明属于应用环境微生物和农业领域，公开了一个龙胆酸双加氧酶及其编码基因和应用。一种龙胆酸双加氧酶基因dsmD，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1，全长1053bp，编码350个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。龙胆酸双加氧酶基因是首个公开能降解麦草畏中间代谢产物3‑氯龙胆酸的基因，它编码的蛋白能将龙胆酸和3‑氯龙胆酸开环降解。本发明提供的龙胆酸双加氧酶能在30min内降解100mg/l的龙胆酸和3‑氯龙胆酸。因此，龙胆酸双加氧酶基因dsmD在构建降解麦草畏转基因作物中应用潜能巨大，龙胆酸双加氧酶蛋白DsmD在降解麦草畏以及苯环类物质中应用前景很好。

技术领域

本发明属于环境微生物和农业领域，涉及一个龙胆酸双加氧酶及其编码基因和应用,具体涉及参与麦草畏微生物降解过程中的一个龙胆酸双加氧酶及其编码基因的应用。

背景技术

化学农药是保障现代农业生产力的重要手段，合理使用农药可以有效的防治作物病害，提高作物产量，但是一旦农药使用不当会造成土壤、水体等环境药害。除草剂的使用能有效减轻农业劳动强度，提高作物产量，但是随着除草剂的大量使用，其残留对土壤造成的危害越来越严重。微生物修复技术是一种原位生物修复技术，效果好，费用低，无二次污染，适合大面积面源污染修复，是土壤有机污染物修复技术的主流和发展方向。抗除草剂转基因是解决除草剂药害的有效途径，而抗除草机的基因一般均来自微生物降解基因。

麦草畏(dicamba)属安息香酸系除草剂，对一年生和多年生阔叶杂草有显著防除效果。麦草畏用于苗后喷雾，药剂能很快被杂草的叶、茎、根吸收，通过韧皮部向上、下传导，多集中在分生组织及代谢活动旺盛的部位，阻碍植物激素的正常活动，从而使其死亡，能防除200多种杂草，广泛应用于玉米、高粱和小麦等农田杂草防治，目前全球使用量达1.5万吨。同时麦草畏因广谱、高效、低毒和杂草抗性产生慢等优点，被认为是理想的抗除草剂转基因靶标除草剂。麦草畏在土壤中稳定，一般能保持40天以上。麦草畏在环境中的降解的主力军是微生物，目前已筛选到多种麦草畏的降解菌株，克隆到多个麦草畏降解基因，关于麦草畏的微生物降解目前基本上第一步都是脱甲基生成无除草活性的3,6-二氯水杨酸3,6-DCSA，克隆到的基因和研究的酶均为麦草畏脱甲基酶。美国孟山都公司利用来自细菌的麦草畏脱甲基酶基因(dmo)(专利US7105724B2)成功构建抗麦草畏和草甘膦复合性状的转基因大豆和抗麦草畏、草甘膦和草铵膦的棉花，已经进入商品化阶段。可以预见，随着抗麦草畏转基因作物的商业化推广，麦草畏的使用量会大幅度提高。但是，到目前为止，微生物降解麦草畏微生物降解的第一步脱甲基产物3,6-DCSA的代谢途径及其分子机制还不清楚，这严重制约了对麦草畏的环境行为和生态安全方面的研究。因此有必要深入研究麦草畏的迁移、转化和降解等环境行为及生态安全性。

获得麦草畏脱微生物代谢过程中降解基因和酶在治理农药残留中主要具有以下作用，(一)通过现代微生物发酵技术将酶制剂实现土壤原位修复。(二)通过现代生物技术将降解基因导入作物构建相应的除草剂抗性转基因作物，综上所述，开展麦草畏降解过程中的降解基因、酶的研究具有非常重要的理论和实际应用价值。

发明内容

本发明的目的是针对现有麦草畏降解途径的研究的缺乏，提供一个龙胆酸双加氧酶基因，该基因参与麦草畏下游降解路径，同时能降解龙胆酸，龙胆酸是苯环类物质降解的主要开环产物之一，龙胆酸双加氧酶基因的应用具有重要的价值。

本发明的又一目的是提供该龙胆酸双加氧酶基因编码的蛋白DsmD的应用。

一种龙胆酸双加氧酶基因dsmD，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

所述的龙胆酸双加氧酶基因dsmD编码的双加氧酶蛋白DsmD，其氨基酸序列为SEQID NO.2。

含有所述的龙胆酸双加氧酶基因dsmD的重组表达载体。

所述的重组表达载体，优选是将所述的龙胆酸双加氧酶基因dsmD插入pET-24b(+)的NdeI和XhoI位点之间所得。