[发明专利]来自蜘蛛的多肽毒素

说明书

本发明涉及适于用作杀虫剂的毒素的分离和特性。

对具有抗昆虫，并且尤其是抗棉铃虫昆虫活性的毒素产生特殊兴趣的原因在于这类昆虫的重大经济学意义。新化合物的鉴定为发展另一类农业杀虫剂提供了基础。

随着昆虫对杀虫剂抗性的增强、人们对杀虫剂不利作用的认识以及逐渐对环境因素的更优先考虑，对取代现有化学性昆虫控制方法的要求也在日益明显。现有控制方法继后花费和所造成的损失使一些先前有利可图的农用工业变得毫无生气。

近来，人们对毒液尤其是蜘蛛毒及其所含毒素的药理和化学检测产生了新的兴趣。

基于一些蜘蛛毒液或者有关具有可逆作用的低分子量多胺毒素能够杀灭某些昆虫，一些作者^1，2，3已提出了从蜘蛛毒中开发出杀虫剂物质的总体方案。

棉铃虫(Heliothis armigera)是澳大利亚农用作物的主要害虫。棉铃虫是一种迁移性飞蛾，其幼虫以多种农作物为食。棉铃虫属具有世界性分布。美洲棉铃虫存在于从加拿大到乌拉圭的美洲大陆。与其非常相似的棉铃虫见于南部欧洲、非洲、近东、中东、远东、澳大利亚、新西兰和许多太平洋岛屿。在澳大利亚，棉铃虫成灾并对棉花、烟草、马铃薯、绿豆、甜玉米、苜蓿、大豆、高粱、豌豆、亚麻子、红花、油菜子、向日葵和白羽扇豆造成严重损害。然而，基于对棉铃虫所付出的代价和因其造成的损失，棉花是目前上述这些作物中最为重要的受害作物。

本发明人从澳大利亚的漏斗网蜘蛛(funnel-web spiders)(Atrax和Hadronyche属)中分离出一同源系列的新型杀虫剂肽，它们具有相对低的分子量(约为4000a.m.u.)，并证明在将此类肽注射到棉铃虫标本中时不可逆的毒性。可以预见此类肽将对大量其它种类的昆虫显示出毒性。通过给诸如蝗虫、蟑螂、麻蝇和甲虫类害虫注射上述毒素已显示出其致死性或毒性。

本发明所分离并确定特性的毒素仅显示出与以前报道的昆虫活性毒素有有限的相似性。例如，从Plectreurys种⁴中分离的昆虫特异性毒素是以相似的乙腈浓度经层析洗脱分离的，它们是单链毒素，估计其分子量为约7000a.m.u.，远大于本发明毒素的约4000a.m.u.的分子量。相反，最初从Hololean种⁵中分离的活性化合物被认为是由总的分子量约16000a.m.u.的二个亚单位组成的，但随后的报道述及从上述昆虫中分离出了单链昆虫毒素¹⁸。据信它们是通过突触前钙通道阻断机制发挥作用的。

在所公开的资料中，来自Agelenopsis毒液⁶的μ-agatoxin与本发明的毒素最为相似，它们具有相似的大小(36-38个残基，分子量约为4200a.m.u.)，并且是单链毒素。

本发明的昆虫活性毒素是一组同源性毒素，完全不同于以前从澳大利亚漏斗网蜘蛛^8，9中分离的哺乳动物毒素，因此预期本发明的毒素对哺乳动物系统没有生物活性。事实上，当分别将500pmol的In2毒素和400pmol的In3毒素注射到一只成年小鼠尾静脉中时未发现有任何活性，并且，已显示出V1对新生小鼠无毒性。

根据本发明的第一个实施方案，本发明提供了一种相对分子量约为4000a.m.u.的多肽毒素，该毒素含有36-37个氨基酸残基，并能够形成3个链间二硫键，这种含二硫键的毒素对幼虫和/或成虫具有毒性，该毒性典型地是根据幼虫的异常运动和在通常时间不能化蛹以致最终死亡来证明的。 

本文所定义的本发明毒素不包括在天然环境中存在的毒素。以适于测序形式分离的毒素一般纯度约为95％，尽管很显然该纯度级并非商业产品所必需的。

本发明包括羧酰胺化和游离酸两种形式的毒素。

本发明的优选毒素为本文所定义的In1、In2、In3、MR1、V1、F1a和F1b。

本发明的毒素可从蜘蛛毒液中分离得到。

它们也可以用化学方法合成，或者通过重组技术从编码毒素或其前蛋白的分离之基因，或从合成基因的cDNA拷贝制得。

用重组技术制备本发明的毒素时，可通过构建编码本发明毒素之氨基酸顺序的DNA探针来制备毒素。