[发明专利]一种构建动态模拟人肝癌转移的体外模型的方法

摘要

本发明公开了一种构建动态模拟人肝癌转移的体外模型的方法，包括抗细胞附着的模型建立，肝癌细胞体外转移模型的建立，对所构建的肝癌体外转移模型的鉴定等步骤。本发明方法应用高转移倾向的BEL7402系肝癌细胞，通过构建使其脱离细胞外基质附着的模型以及模拟转移细胞遇到合适环境再贴壁生长的状况，模拟和建立了肝癌细胞转移的体外模型。利用该模型可以进行原位癌和转移过程中的肿瘤的对照研究，并可进一步作为检测转移中的肿瘤细胞生物学行为和判断肿瘤预后的监测系统。该模型对于进行临床肿瘤转移机制的研究和控制转移药物的筛选有重要价值，并可作为制备抗肿瘤转移基因疫苗及建立抗肿瘤转移药物筛选技术平台。

主权项

1.一种构建动态模拟人肝癌转移的体外模型的方法，包括抗细胞附着的模型建立，肝癌细胞体外转移模型的建立，对所构建的肝癌体外转移模型的鉴定，其特征是：所述抗细胞附着模型的建立方法是：用95％-100％的乙醇溶解poly-HEMA，配成poly-HEMA终浓度为120mg/ml的溶液，65℃震荡混匀8-10小时，得poly-HEMA储备液；然后将poly-HEMA储备液按体积比1∶10的比例用95％-100％的乙醇稀释，制成终浓度为12mg/ml的poly-HEMA工作液，4℃保存，备用；取poly-HEMA工作液均匀铺到细胞培养板或细胞培养瓶的底面上，铺板时poly-HEMA工作液终密度为1mg-3mg/cm2，室温下自然晾干poly-HEMA工作液，得抗细胞附着模型，4℃保存，备用；所述肝癌细胞体外转移模型建立的方法是：选取具有高转移力的、处于对数生长期的BEL-7402细胞，用0.25％胰酶消化成单细胞悬液后，调整细胞浓度为1-5×105个细胞/ml，然后将其分成两组，一组接种至上述抗细胞附着模型中，设定为悬浮细胞组，另一组接种至非抗细胞附着模型的细胞培养板或细胞培养瓶中，设定为贴壁细胞组，待细胞铺匀后置37℃，CO2培养箱中培养12h-48h，获得的悬浮细胞组细胞即为肝癌细胞脱离附着的体外转移模型，获得的贴壁细胞组细胞为肝癌细胞贴壁生长的对照模型；所述对所构建的肝癌体外转移模型鉴定的指标特征是：在台盼兰染色确定悬浮细胞组和贴壁细胞组细胞存活率不低于97％的前提下，①悬浮细胞组和贴壁细胞组细胞凋亡率低于5％；②悬浮细胞组与贴壁细胞组细胞形态对比，悬浮组细胞聚集成团，没有突起伸出，细胞仍为圆球型，细胞在悬浮后4h出现聚集，36h细胞聚集更紧，呈现融合状态，随着时间的推移，贴壁组细胞由伸出突起开始逐渐伸展，铺成单细胞层，而悬浮组的细胞形态呈圆形，并逐渐聚集成团，所聚成的细胞团块随着时间的推移越聚越大；③细胞生长曲线显示，贴壁组细胞呈旺盛增殖曲线，悬浮组细胞处于静止状态，既不增殖，也不凋亡，呈基本持平曲线；④流式细胞仪检测各细胞周期的细胞分布显示，悬浮组细胞为处于G0/G1期的静止状态的细胞，而贴壁组细胞大多处于增殖旺盛的G2/M期；⑤悬浮组细胞在再次遇到适于贴壁的环境时，能够在没有任何外界刺激的情况下，重新贴壁，并且重新进入细胞周期和旺盛的增殖状态。