[发明专利]里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1的重组载体、重组菌及在重组菌中的表达

摘要

本发明公开了里氏木霉(Trichoderma reesei)β-葡萄糖苷酶基因BGL1的重组载体、重组菌及在重组菌中的表达，构建含有里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1的重组载体：(1)PCR扩增里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1，连接至TA载体；(2)里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因BGL1构建至巴斯德毕赤酵母表达载体；本发明重组菌能有效地表达目的蛋白里氏木霉β-葡萄糖苷酶BGL1。克服了现有技术从里氏木霉中无法大量纯化出β-葡萄糖苷酶的不足。自然界中有诸多废弃木质纤维素，本发明的方法能提高β-葡萄糖苷酶的产量，对提高纤维素的降解效率、高效的利用废弃的纤维素生产能源，解决当前能源危机具有极其重要意义。

主权项

里氏木霉β‑葡萄糖苷酶基因BGL1的重组载体，其特征是用下述方法构建：(1)提取里氏木霉(Trichoderma reesei)CICC 13052的总RNA，反转录成cDNA，以该cDNA为模板，用序列表中SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为上、下游引物进行PCR，扩增出序列表中SEQ ID NO.3所示2235bp的里氏木霉β‑葡萄糖苷酶基因BGL1，连接至TA载体pGEM‑T，获得含有里氏木霉β‑葡萄糖苷酶基因BGL1的质粒pGEM‑BGL1；(2)里氏木霉β‑葡萄糖苷酶基因BGL1构建至巴斯德毕赤酵母表达载体：以所述质粒pGEM‑BGL1为模板，以序列表中SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示核苷酸序列为上、下游引物进行PCR扩增，获得序列表中SEQ ID NO.6所示的2198bp片段，将所述2198bp片段连接至TA载体pGEM‑T，命名为pTBGL1；提取质粒pTBGL1和巴斯德毕赤酵母表达载体pPICZalpha C质粒，用Cla I和XbaI同时酶切pTBGL1和pPICZalpha C质粒，经琼脂糖凝胶电泳后回收酶切pTBGL1得到SEQ ID NO.7所示的2183bp片段和酶切pPICZalpha C得到的SEQ ID NO.8所示的3530bp片段；回收产物连接后转化到大肠杆菌TOP10F′的感受态细胞中，涂含Zeocin 25μg/mL的LB平板，培养12‑16h，得到含pPICZalpha C‑BGL1质粒的大肠杆菌，提取大肠杆菌中pPICZalpha C‑BGL1质粒，即得到含有里氏木霉β‑葡萄糖苷酶基因BGL1的重组载体。