[发明专利]一种莴苣原生质体的提取方法

摘要

本发明涉及一种莴苣原生质体的提取方法，该方法由莴苣无菌苗的培养、原生质体的质壁分离、原生质体的酶解以及原生质体的纯化四个步骤完成。该方法以提高莴苣原生质体的活力，简单易于操作，分离材料易于得到，酶解的方法简单，去除细胞壁条件温和，分离的原生质体得率高，活性强，易于莴苣原生质体的培养和植株再生，为原生质体融合奠定了基础。另外原生质体的超低温保存对于有优良性状的种质资源的保存也有极其重要的价值。

主权项

一种莴苣原生质体的提取方法，其特征在于按下列步骤进行：a、取莴苣种子，用自来水流动冲洗40‑120 min，然后将种子在超净工作台上用75%酒精表面消毒10‑60s，用0.1%升汞灭菌2‑10 min，再用无菌水冲洗4‑6次；b、将步骤a中处理后的莴苣种子接入诱导培养基1/2MS，温度20±1℃，光照2500‑3000 lx，时间16 h/d，培养时间15‑35d；c、将步骤b中培养出的无菌苗，切碎后浸入原生质体清洗液+13%甘露醇溶液中进行质壁分离，在温度25℃黑暗条件下，处理1‑4小时；d、将步骤c中的质壁分离液慢慢倒出，将叶片置于pH5.4‑6.2的酶液中，温度20‑28℃，转速40‑80rpm，黑暗条件下震荡12‑16小时进行酶解；e、将步骤d中的叶片组织，用300‑500目的细胞筛过滤，然后500r/min离心沉淀原生质体，弃去上清液，加入原生质体清洗液+13%甘露醇的清洗液混匀，进行原生质体清洗，弃去上清液，将原生质体的沉淀用移液枪吸出铺在原生质体清洗液+15‑25%的蔗糖溶液上，1000r/min条件下离心5‑10min,即可得到处于中间部分的莴苣原生质体。