[发明专利]一种H9N2亚型禽流感病毒的大规模培养方法

摘要

本发明公开了一种H9N2亚型禽流感病毒的大规模培养方法，本方法中H9N2病毒在MDCK适应快速，适应后病毒HA效价为28；以7.5L反应器为种细胞罐，cytodex1为载体培养MDCK细胞为种子细胞，放大到40L固定床篮式搅拌系统反应器的大规模培养，收获血凝效价（HA）可以达到210H9N2病毒80L。本方法生产的病毒效价高、产量大，方法易于标准化，适用于所有的H9亚型流感病毒，解决了目前H9N2禽流感病毒在MDCK细胞上培养病毒滴度不能满足疫苗生产的难题。

主权项

一种H9N2亚型禽流感病毒的大规模培养方法，其步骤是:禽流感病毒H9N2快速适应MDCK细胞：H9N2在MDCK细胞上的快速适应：F60‑F105代MDCK细胞6孔板中长满单层，病毒36.5‑37.5℃吸附1‑2小时，去除病毒液，以含TPCK‑胰酶1.0‑1.5ug/ml的高糖DMEM为病毒稀释液清洗MDCK细胞2‑4次后，更换含TPCK‑胰酶0.3‑1.8ug/ml高糖DMEM细胞维持液，取血凝效价>24且病毒稀释倍数最高的病毒液或者致细胞最晚产生病变的最高稀释倍数病毒作为种子病毒继续适应；病毒在6代以内适应MDCK细胞，且病毒血凝效价为28；以F6‑F11代次病毒为40L反应器种子病毒；其血凝效价≥28；EID50≥107.5；1）.7.5L搅拌式反应器培养种子细胞：以Cytodex1为载体，2‑10g/L载体投放量，以pH7.2的PBS水化并平衡载体后，随罐体灭活，更换含体积比为8‑10％的新生牛血清DMEM完全培养基；细胞接种量为0.35‑1.4*108个细胞/克载体，细胞贴壁阶段搅拌转速40r/min ，DO为60％，温度为36‑37℃，pH为7.0‑7.3；细胞培养阶段依据细胞耗氧，搅拌转速控制40‑80r/min，依据反应器中糖浓度1.8‑2.2g/L，培养调整灌流速度为5‑40ml/min；细胞培养50‑70小时细胞生长至单层，细胞密度为1.6‑8.3*106/ml；2）7.5L搅拌式反应器 →40L篮式固定床反应器培养：（1）40L固定篮式反应器准备：40L固定篮式反应器准备：按照40g /L 取FibraCel Discs载体1440g，置于反应器中一起灭菌后，向反应器中加入32％新生牛血清的DMEM培养基至16L,使温度稳定至37℃，pH为7.2；（2）消化7.5L搅拌式反应器种子细胞接种到40L篮式固定床反应7.5L反应器中细胞密度达到5.3*106/ml，停止搅拌，载体沉淀后去除培养基，以37℃预温热PBS清洗载体4次，含质量浓度0.02%EDTA、0.25%胰酶的消化液清洗一次后，加入1L质量浓度0.25%胰酶的消化液，同时25rpm搅拌20分钟后，快速加入4L DMEM，搅拌转速调整25rpm后，通过软管快速抽取细胞和DMEM混合液3L至提前准备好的40L反应器中；再次抽取3L DMEM加入7.5L反应器中，调节搅拌转速至40rmp搅拌5分钟后，降至25转，通过软管快速抽取细胞和DMEM混合液3L至反应器中，如此反复操作5次；调节40L反应器转速至75rpm、温度至35‑37℃、溶氧至30‑90%、pH为7.2；细胞1小时内贴壁；（3）40L反应器中培养MDCK细胞细胞贴壁后调节40L反应器转速至75‑120rpm、温度至37℃、溶氧至60%、pH为7.2；每6小时测糖浓度，24小时反应器糖浓度达到细胞生长所需要的极限值1.5g/L，随时调节灌流速度，使反应器培养基的糖浓度维持在1.8‑2.8g/L；细胞在72小时达到平台期， 70小时以内细胞处于高活力状态，为病毒接种最佳时间；（4）40L反应器中病毒接种H9N2流感病毒：40L反应器培养MDCK细胞接种病毒前，依次用PBS、含1.2‑1.5ug/ml TPCK‑胰酶的DMEM清洗细胞，病毒接种MOI为0.01‑0.00001；病毒吸附过程中TPCK‑胰酶浓度1.2‑1.5ug/ml，温度36.5‑37.5℃，搅拌转速40‑60r/min，DO为60％，pH为7.0‑7.6，病毒吸附2小时；病毒培养阶段细胞维持和病毒培养温度为33‑35℃，搅拌转速60‑120r/min， 4‑6小时后更换细胞维持液；（5）40L反应器中病毒增殖及血凝效价监测：病毒培养阶段细胞维持和病毒培养温度为33‑35℃，搅拌转速60‑120r/min，4‑6小时后更换含0.2‑0.8ug /ml TPCK‑胰酶的DMEM；灌流培养速度为50‑400ml/min，糖浓度保持2.2‑3.0g/L；病毒培养30小时开始监测病毒HA效价，病毒血凝效价达到22－4时，反应器进入产毒阶段，调节温度为35－37℃，搅拌转速60‑90r/min，糖浓度保持1.0‑2.8g/L， HA效价最高为211，收获210病毒液80L。