[发明专利]一种PEG介导胶孢炭疽病菌原生质体遗传转化的方法

摘要

本发明公开一种PEG介导胶孢炭疽病菌原生质体遗传转化的方法，通过胶孢炭疽病菌原生质体的制备、转化和转化子的筛选，将含有筛选标记的外源DNA片段转到胶孢炭疽病菌基因组中；本发明实现了胶孢炭疽病菌原生质体遗传转化，建立了一套完整的遗传转化方法，获得大量高强度表达绿色荧光蛋白且稳定遗传的转化子，转化效率可达20‑22个转化子/ug DNA，转化效率高、稳定性好。

主权项

1.一种PEG介导梨胶孢炭疽病菌原生质体遗传转化的方法，其特征在于，步骤如下：（A）将胶孢炭疽病菌菌丝置于酶解液中，30℃，60rpm振荡2h，以双层Miracloth过滤后取胶孢炭疽病菌原生质体，于4℃，3000rpm离心10min；离心后取沉淀加入STC缓冲液悬浮原生质体，于4℃，3000rpm离心5min；再次取沉淀，加入STC缓冲液悬浮胶孢炭疽病菌原生质体，使其终浓度为10⁸个/ml，胶孢炭疽病菌菌丝与酶解液的加入比例为每5ml酶解液中加入0.25g胶孢炭疽病菌菌丝；所述胶孢炭疽病菌菌丝是这样获得的：（1）将胶孢炭疽病菌菌丝块接种到PSA培养基上，26℃黑暗培养10d，过滤收集孢子；（2）将步骤（1）收集的孢子接种到CM液体培养基中，26℃，150rpm振荡培养24h；（3）向步骤（2）的培养基中再添加新的CM液体培养基，26℃，150rpm继续振荡培养24h后，过滤收集菌丝，即获得所述胶孢炭疽病菌菌丝；所述CM液体培养基是这样获得的：20×Nitratesalts 20ml，Vitaminsolution 1ml，Traceelements 1ml，D‑Glucose10g，加ddH₂O定容至1L；其中，20×Nitratesalts配方为：NaNO₃ 120g，KCl 10.4g，MgSO₄·7H₂O 10.4g，KH₂PO₄ 30.4g，加ddH₂O定容至1L；Vitaminsolution配方为：Biotin 0.01g，Pyridoxin 0.01g，Thiamine 0.01g，Riboflavin 0.01g，PABA 0.01g，Nicotnicacid 0.01g，加ddH₂O定容至1L；（B）将2μg pYF11质粒DNA加入200μl步骤（A）获得的胶孢炭疽病菌原生质体中，混匀后室温静置25min；然后加入1mlPTC缓冲液，混匀后室温静置25min；然后倒入10ml含200μg/ml博莱霉素的TB3固体培养基，混匀后倒入培养皿中，26℃，黑暗培养24h；向培养皿中倒入10ml含400μg/ml博莱霉素的TB3固体培养基，26℃下黑暗培养7～10d挑出转化子；（C）将转化子加入含有400μg/ml博莱霉素的PSA培养基中，26℃黑暗培养，连续培养3代，筛选性状稳定的转化子，即为原生质体遗传转化转化后的胶孢炭疽病菌；所述酶解液是这样获得的：取0.045g的裂解酶和0.005g的蜗牛酶，加入0.7M NaCl溶液至5ml，再用0.22um细菌过滤器过滤。