[发明专利]一种茶树原生质体的提取方法

摘要

一种茶树原生质体的提取方法，属于植物原生质体技术领域。该方法用茶树花瓣作为提取材料，由花朵采集、原生质体酶解、释放和纯化四个步骤完成。上述一种茶树原生质体的提取方法，分离材料易于得到，提取操作简单，分离得到的原生质体数量多，得率高，完整性高，为原生质体转染及原生质体融合奠定了基础。

主权项

 一种茶树原生质体的提取方法，其特征在于包括以下步骤：1）在茶花盛开季节选取长势较好、无病虫害的茶树花朵；2）用新刀片或剪刀将置于洁净白纸上的花瓣前端和尾部去除后，快速将中间部分切成0.5‑1 mm 宽的细条，快速、轻柔地转移到盛有酶解液的培养皿中，并使花瓣完全沉浸于酶解液中；酶解液配制：19‑21 mM 2‑(N‑吗啉代)乙磺酸，1.4‑1.6﹪纤维素酶R10，0.3‑0.5﹪离析酶R10，0.3‑0.5 M甘露醇，19‑21 mM氯化钾，加入以上试剂后先50‑60℃水浴加热8‑15分钟，冷却至室温后再加入9‑11 mM氯化钙，4‑6 mM β‑巯基乙醇，0.8‑0.12﹪牛血清蛋白，定容后调pH至5.5‑5.8，0.45 µm过滤灭菌，现用现配；3）盖上皿盖，置于真空泵中于黑暗条件下抽真空40 min‑1 h，抽真空后，继续置于黑暗条件下放置3.5‑4.5 h，轻柔晃动，若看到花瓣呈透明状并已萎蔫，说明原生质体已经基本释放完全，将培养皿置于显微镜下观察释放情况；4）用洗涤缓冲液稀释上述原生质体溶液，轻轻晃动混匀；洗涤缓冲液配制：1.8‑2.2 mM 2‑(N‑吗啉代)乙磺酸，150‑158 mM氯化钠，122‑127 mM氯化钙，4.8‑5.2 mM氯化钾，定容后调pH至5.5‑5.8，0.45 µm过滤灭菌；5）用无菌水清洗70 µm的尼龙网，晾干后用洗涤缓冲液润湿尼龙网，过滤步骤4）中的酶解液，再用洗涤缓冲液洗培养皿2‑3次，洗涤缓冲液的用量和所用酶解液等体积；6）将原生质体悬浮液移至50 ml离心管，室温下最大离心力100× g，离心机升速和降速的制动设为1‑2，离心3.5‑4.5 min，弃上清，收集原生质体。