[发明专利]树兰蒴果60Co-γ射线辐射诱变方法

摘要

本发明公开了一种树兰蒴果60Co‑γ射线辐射诱变方法，选择树兰属的树兰种子，确定培养基和培养条件，分组用60Co‑γ射线进行辐射处理后，统计确定半致死剂量LD50，并用相关软件拟合为直线方程；将种子萌发的原球茎接入分化培养基中，培养分化出再生植株，120d后调查再生植株分化的情况及形态学指标，分析不同剂量辐射组与对照组的差异。在组织培养条件下利用60Co‑γ进行诱变处理，观察不同辐射剂量对树兰种子的诱变效应，确定适宜辐射剂量。建立树兰蒴果60Co‑γ射线辐射诱变育种技术，为其辐射诱变育种适宜剂量的选择和确定提供依据，并选育获得新品种。方便取材、可以降低污染率、节约时间成本。

主权项

一种树兰蒴果60Co‑γ射线辐射诱变方法，其特征在于，选择树兰属的树兰蒴果，包括步骤：A、培养基和培养条件：用于胚的萌发实验的培养基：MS、1/2MS、1/4MS；种子萌发培养基：1/2MS；原球茎分化培养基：MS；原球茎繁殖培养基：花寳1号改良培养基；以上培养基pH 5.8‑6.0，121℃恒温灭菌20min，培养条件为温度24(±2)℃、光照强度1600‑2000lx、光照时间为14h/d；B、辐射处理：取同一植株上花期一致、授粉时间一致、长势一致的树兰蒴果为试验材料，分组用60Co‑γ射线进行辐射处理；辐射处理后树兰种子的处理如下：使用蘸有75％酒精的棉球轻轻擦拭外果皮3遍；移入超净工作台后，再用同样的方法擦拭3遍；将消毒后的材料播入无菌三角瓶中，加入无菌水并加入一滴吐温80制成100ml均匀的悬浮液，再用移液枪吸取约700μl，播入1/2MS培养基中，每个剂量处理有4组，每组为5瓶。用血球计数板法统计各剂量悬浮液的种子密度，每个剂量10次重复；C、统计萌发时间、萌发率及相对成活率：观察统计每个剂量处理开始萌发的时间及60天内的萌发种子数：计算种子的萌发率和相对成活率，萌发率＝萌发的个数/接种的个数×100％；相对成活率＝萌发率/对照萌发率×100％。D、半致死剂量的确定：确定半致死剂量LD50：以辐射剂量作为自变量x，不同剂量辐射后种子的相对成活率y作为因变量，应用直线回归方程y＝a+bx和下式(1)、(2)来计算60Co‑γ射线对树兰种子的半致死剂量LD50；$b=\frac{\mathrm{\Σ}xy-\frac{\mathrm{\Σ}x\·\mathrm{\Σ}y}{N}}{{\mathrm{\Σx}}^2-\frac{{\left(\mathrm{\Σ}x\right)}^2}{N}}$$a=\frac{\Σy-b\·\Σx}{N}$$x=\frac{50-a}{b}---\left(1\right);$式中：a是常数，b是回归系数，x是半致死量；相关系数公式：$r=\frac{\mathrm{\Σ}xy-\frac{\mathrm{\Σ}x\·\mathrm{\Σ}y}{N}}{\sqrt{\[{\mathrm{\Σx}}^2-\frac{{\left(\mathrm{\Σ}x\right)}^2}{N}\]}\[{\mathrm{\Σy}}^2-\frac{{\left(\mathrm{\Σ}y\right)}^2}{N}\]}---\left(2\right);$利用上述公式计算相对萌发率与辐射剂量之间的相关系数，使用相关软件拟合为直线方程；E、辐射处理对树兰再生植株产生的辐射效应：将萌发的原球茎接入分化培养基中，培养分化出再生植株，120d后调查再生植株分化的情况及形态学指标，包括叶宽、叶长、叶片数、株高，比较不同剂量辐射组与对照组的差异；F、数据处理与统计方法：利用Excel软件、SPSS 22.0软件、DPS软件对试验数据绘制图表、方差分析、相关分析、回归分析及Duncan多重比较。