[发明专利]猪多能干细胞定向诱导分化为雄性生殖细胞的方法及专用培养基

摘要

本发明公开了一种猪多能干细胞定向诱导分化为雄性生殖细胞的方法及专用培养基。本发明提供了专用培养基，包括EpiLC诱导培养基、PGCLC诱导培养基和SSCLC诱导培养基；本发明的实验证明，本发明提供了在体外将猪多能干细胞向原始生殖细胞样细胞(PGCLC)定向诱导分化的方法，PGCLC可以进一步诱导分化形成精原干细胞样细胞(SSCLC)；在体内，将诱导的细胞注射到去除内源精子的小鼠曲细精管中，PGCLC和SSCLC可以存活并进一步发育。因此，本发明为猪多能干细胞向生殖细胞的定向分化提供了可行有用的方案，为探索生殖细胞发育机制等奠定了基础。

主权项

1.一种猪多能干细胞定向诱导分化为雄性生殖细胞的专用培养基，包括EpiLC诱导培养基、PGCLC诱导培养基和SSCLC诱导培养基；所述EpiLC诱导培养基中含有bFGF和ActivinA，且所述bFGF在所述EpiLC诱导培养基中的浓度为12 ng/mL，所述ActivinA在所述EpiLC诱导培养基中的浓度为20ng/mL；所述PGCLC诱导培养基中含有BMP4、BMP8a、SCF 、EGF和LIF，且所述BMP4在所述PGCLC诱导培养基中的浓度为50ng/mL，所述BMP8a在所述PGCLC诱导培养基中的浓度为50ng/mL，所述SCF在所述诱导PGCLC诱导培养基中的浓度为50ng/mL，所述EGF在所述PGCLC诱导培养基中的浓度为50 ng/mL，所述LIF在所述诱导PGCLC诱导培养基中的浓度为1000U/mL；所述SSCLC诱导培养基中含有睾酮、RA和GDNF，且所述的睾酮在所述SSCLC诱导培养基中的浓度为1μM，所述RA在所述SSCLC诱导培养基中的浓度为2μM，所述GDNF在所述诱导SSCLC诱导培养基中的浓度为4ng/mL；所述EpiLC诱导培养基由KSR血清替代物、N2、B27、GlutaMAX、Nonessential amino acids、2‑Mercaptoethanol、DMEM、bFGF和ActivinA组成；所述KSR血清替代物在所述EpiLC诱导培养基中的体积百分含量为1%‑5%；所述N2在所述EpiLC诱导培养基中的体积百分含量为1%；所述B27在所述EpiLC诱导培养基中的体积百分含量为2%；所述GlutaMAX在所述EpiLC诱导培养基中的体积百分含量为1%；所述Nonessential amino acids在所述EpiLC诱导培养基中的体积百分含量为1%；所述2‑Mercaptoethanol在所述EpiLC诱导培养基中的体积百分含量为0.1%；所述DMEM在所述EpiLC诱导培养基中的体积百分含量为93.9‑89.9%；所述PGCLC诱导培养基由KSR血清替代物、GlutaMAX、Nonessential amino acids、2‑Mercaptoethanol、GMEM、BMP4、BMP8a、SCF 、EGF和LIF组成；所述KSR血清替代物在所述PGCLC诱导培养基中的体积百分含量为15%；所述GlutaMAX在所述PGCLC诱导培养基中的体积百分含量为1%；所述Nonessential amino acids在所述PGCLC诱导培养基中的体积百分含量为1%；所述2‑Mercaptoethanol在所述PGCLC诱导培养基中的体积百分含量为0.1%；所述GMEM在所述PGCLC诱导培养基中的体积百分含量为82.9%；所述SSCLC诱导培养基由FBS、GlutaMAX、Nonessential amino acids、2‑Mercaptoethanol、DMEM、睾酮、RA和GDNF组成；所述FBS在所述SSCLC诱导培养基中的体积百分含量为15%；所述GlutaMAX在所述SSCLC诱导培养基中的体积百分含量为1%；所述Nonessential amino acids在所述SSCLC诱导培养基中的体积百分含量为1%；所述2‑Mercaptoethanol在所述SSCLC诱导培养基中的体积百分含量为0.1%；所述DMEM在所述SSCLC诱导培养基中的体积百分含量为82.89%。