[发明专利]一种改变TRPC6在催产素神经元中表达的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种改变TRPC6在催产素神经元中表达的方法及其应用，该方法通过TRPC6的激动剂上调TRPC6研究疼痛状态下内源性催产素神经元的特点，揭示其合成和释放催产素的分子机制，包括慢性痛状态下TRPC6的表达趋势和α1受体与TRPC6的共存情况。本发明的技术方案为痛与镇痛的研究提供新的分子靶标，也为阐明神经内分泌神经元体系的工作原理、进一步揭示TRPC6的在体生理病理功能提供理论支持。

主权项

一种改变TRPC6在催产素神经元中表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：①慢性痛状态下TRPC6的表达趋势a)RT‑PCR法检测TRPC6 mRNA随慢性痛时程的表达变化组织的准备：CFA炎性痛大鼠造模后12h、24h、48h、72h、96h、SNL模型大鼠造模后1d、3d、7d、14d、28d，吸入麻醉，冰上快速断头取脑，在视交叉前缘和灰结节之间做冠状切片，紧邻第三脑室上侧和视束外侧行“门”行修片，将修好的包含有全部视上核和室旁核的组织置于液氮中保存；RT‑PCR检测：取不同组的组织约1g，匀浆，提取总RNA，oligo做引物反转录总mRNA，TRPC6特异性引物扩增，分析TRPC6 mRNA随疼痛进程的表达趋势，找出变化最明显的时间点；b)Western blot法检测TRPC6蛋白质水平的表达变化如上取视上核和室旁核组织，高速匀浆或超声破碎，含2‑巯基乙醇的载样缓冲液中煮沸3‑5min，离心取上清，电泳，转膜，脱脂奶粉封闭，TRPC6一抗，二抗孵育，ECL显色，与PCR结果进行比对，找出蛋白质变化最明显的时间点；c)免疫组织化学法检测TRPC6蛋白的表达变化正常、假手术组和根据上述PCR和WB检测后选择出来的TRPC6表达变化最明显的时间点疼痛大鼠，乌拉坦麻醉，4％多聚甲醛灌注固定，浸糖过夜，取下丘脑和垂体行冰冻切片，切片分3套保存，一套行TRPC6免疫组化染色；一套行Nissl染色；一套行抗原吸收对照染色，比较视上核、室旁核及垂体内TRPC6免疫反应阳性产物的组间差别；d)表面生物素化反应检测TRPC6的上膜情况假手术组和痛模型组大鼠吸入麻醉，断头取脑，下丘脑视交叉区震动切片，通氧复苏1h，轻柔修片抠出视上核和室旁核部位，胶原酶37℃恒温消化20min，机械性吹打分离细胞，贴壁沉淀30min，换液后轻柔吹打成细胞悬液，加入sulfo‑NHS‑SS标记的生物素4℃孵育45min，加入氨基乙酸去除多余的生物素，裂解液裂解细胞，蛋白定量，取1mg蛋白加入链酶亲和素琼脂糖制剂4℃过夜，洗提样本，70℃30min处理样本，SDS‑PAGE，用TRPC6抗体行Western blot，比较TRPC6分子在疼痛状态下的膜定位变化情况；e)免疫电镜术检测TRPC6在亚细胞水平的分布正常和疼痛大鼠，灌注固定取脑，震动切片，冰冻保护液孵育后行液氮冻融，20％正常羊血清封闭，TRPC6、催产素一抗孵育，纳米金标记TRPC6，ABC‑DAB法呈色催产素，锇酸后固定，醋酸双氧铀染色，梯度酒精脱水，环氧丙烷脱脂后平板包埋，取下SON、PVN及垂体后叶，超薄切片，电镜下寻找金标颗粒和DAB呈色产物，分析TRPC6的亚细胞分布及其和催产素囊泡的定位关系；②α1受体与TRPC6的共存情况a)免疫荧光多重染色正常成年SD大鼠、痛模型动物，4％多聚甲醛常规灌注固定，下丘脑冰冻切片，免疫荧光双标或三标染色，激光共聚焦显微镜观察拍照，观察α1受体与TRPC6和催产素的共存情况及共存率；b)Western blot验证代谢型受体的动态变化情况如①a)取上述大鼠的视上核和室旁核组织，高速匀浆或超声破碎，含2‑巯基乙醇的载样缓冲液中煮沸3‑5min，离心取上清，电泳，转膜，脱脂奶粉封闭，α1受体一抗、二抗孵育，ECL显色，分析α1受体随疼痛时程的表达情况，比对α1受体和TRPC6表达趋势的异同。