[发明专利]一种体外高效扩增NK细胞的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种体外高效扩增NK细胞的方法及其应用，解决了传统地方法扩增的NK细胞表现出低扩增倍数、细胞因子依赖性、细胞衰老等问题，其技术方案要点是如下步骤：Step1.通过传统的Ficoll‑Paque密度梯度离心法从人的外周血中分离出PBMC；Step2.将人工抗原递呈细胞经100Grays辐照处理后，液氮冻存；Step3.将PBMC与辐照处理后的人工抗原递呈细胞按质量比为1:2的比例在添加有50IU/mL白介素2的RPMI 1640培养基的T75的细胞培养瓶内共培养，每2‑3天更换新鲜培养基；Step4.每隔7天，计算T75的细胞培养瓶内的总细胞数目，添加等细胞数目的辐照处理后的人工抗原递呈细胞再次刺激，连续培养21天，得到扩增后的NK细胞，得到了获得大量高纯度高质量NK细胞的方法。

主权项

1.一种体外高效扩增NK细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：Step1.通过传统的Ficoll‑Paque密度梯度离心法从人的外周血中分离出PBMC；Step2.将人工抗原递呈细胞经辐照处理后，液氮冻存；Step3.将PBMC与辐照处理后的人工抗原递呈细胞按质量比为1:2的比例在添加有白介素2的RPMI 1640培养基的T75的细胞培养瓶内共培养，每2‑3天更换新鲜培养基；Step4.每隔7天，计算T75的细胞培养瓶内的总细胞数目，添加等细胞数目的辐照处理后的人工抗原递呈细胞再次刺激，连续培养21天，得到扩增后的NK细胞；其中，所述人工抗原递呈细胞为K562‑mb.IL21＋CD137L细胞株，所述K562‑mb.IL21＋CD137L细胞株包括稳定表达细胞膜结合型的白介素21和CD137配体的K562细胞株，所述细胞膜结合型的白介素21和CD137配体通过T2A连接，所述K562‑mb.IL21＋CD137L细胞株的细胞系内整合有慢病毒载体，所述慢病毒载体上装载有可转录成上述氨基酸序列的基因序列，所述白介素2的剂量为40~70IU/mL，扩增后的NK细胞的端粒长度要比扩增之前的NK细胞的端粒长度长8~15倍。