[发明专利]基于马泰勒虫裂殖子表面蛋白1的间接ELISA检测试剂盒制备方法

摘要

本发明为基于马泰勒虫裂殖子表面蛋白1的间接ELISA检测试剂盒制备方法，包括马泰勒虫EMA1蛋白的制备与马泰勒虫病rELISA检测方法的建立。本发明解决常规检测试剂盒昂贵、特异性差、耗时等缺点，建立马泰勒虫病rELISA检测方法，适用于马泰勒虫病的临床诊断和流行病学监测。

主权项

1.一种基于马泰勒虫裂殖子表面蛋白1的间接ELISA检测试剂盒制备方法，其特征是：马泰勒虫EMA1蛋白的制备：（1）在含100μg/mL氨苄青霉素的50mLLB培养基中进行诱导，测定重组蛋白的表达情况，在37℃与200rpm/min环境中诱导5h，加入1.0mMol/L的诱导剂IPTG，通过12%的十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶SDS‑PAGE电泳分析蛋白质表达情况；（2）根据KCl染色切胶纯化法收集最佳诱导条件下菌体样品，菌体样品处理后进行SDS‑PAGE电泳，用适量的0.25mol/L的KCl溶液染色后，切下其目的条带碾碎，加入500μL后PBS经涡旋仪混匀，置于‑80℃环境中反复冻溶3次后12000r/min离心2min，取上清，用紫外分光光度仪测定上清中的蛋白浓度，再置于‑20℃环境中保存备用；马泰勒虫病rELISA检测方法的建立：（1）取10μl重组蛋白样品‑5μg的蛋白含量进行SDS‑PAGE电泳后，半干转印于NC膜上；（2）用由0.5%Tween的PBS稀释而成的5.0%脱脂奶作为相应包含质量比为1：100的血清与脱脂奶在内的封闭液后，给酶标板中的每个孔滴加150μl封闭液，再将其置于37℃环境中封闭1.0h；（3）加入稀释的一抗‑马泰勒虫阳性血清后，在37℃环境中反应1.5h；（4）加入由5.0%脱脂奶稀释而成的包含质量配比为1:10000的二抗和脱脂奶在内的二抗稀释液后，置于37℃环境中温育1.0h；（5）在NC膜上滴加DAB显色液，在避光环境中加入TMD底物溶液后，置于37℃培养箱中孵育反应10min，再加入50μL2Mol/L的H2SO4终止反应，用酶标仪在450nm处测定OD值，判定其结果。