[发明专利]一种草鱼肠巨噬细胞的分离、纯化与原代培养方法有效
申请号: | 201710816631.4 | 申请日: | 2017-09-12 |
公开(公告)号: | CN107523542B | 公开(公告)日: | 2019-06-25 |
发明(设计)人: | 李槿年;肖宁;陶会竹;赵雨婷;李琳;刘雪兰 | 申请(专利权)人: | 安徽农业大学 |
主分类号: | C12N5/0786 | 分类号: | C12N5/0786 |
代理公司: | 合肥和瑞知识产权代理事务所(普通合伙) 34118 | 代理人: | 王挺;郑琍玉 |
地址: | 230036 *** | 国省代码: | 安徽;34 |
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摘要: | 本发明涉及一种草鱼肠巨噬细胞的分离、纯化与原代培养方法。分离方法为:无菌操作取出肠道中后段,除去肠道外脂肪与肠系膜,纵向剖开肠管清除粪便,使用无菌弯头镊子刮除草鱼肠黏液与上皮细胞层,刮除时间15min;将除去黏液和上皮细胞层的肠段处理成碎块置于胶原酶IV消化液中消化,获得固有层单细胞悬液;再用鱼类脏器单核细胞分离试剂盒分离肠巨噬细胞。纯化方法为:采用差异贴壁法纯化肠巨噬细胞。原代培养方法为:用含草鱼自体血清的RPMI 1640完全培养液培养肠巨噬细胞,待细胞贴壁后用含脂多糖的RPMI 1640完全培养液换液一次,以后每隔2天换液一次,细胞至少可存活20天。本发明建立了一种可操作性强、重复性好的草鱼肠巨噬细胞分离、纯化和原代培养方法。 | ||
搜索关键词: | 巨噬细胞 原代培养 草鱼 上皮细胞层 刮除 鱼肠 种草 肠管 碎块 肠道外脂肪 单细胞悬液 分离试剂盒 培养液换液 培养液培养 单核细胞 胶原酶IV 无菌操作 细胞贴壁 自体血清 纵向剖开 镊子 段处理 固有层 消化液 脂多糖 中后段 肠道 换液 贴壁 弯头 无菌 脏器 粪便 存活 鱼类 取出 细胞 消化 | ||
【主权项】:
1.一种草鱼肠巨噬细胞的分离方法,其特征在于包括以下步骤:S1、在无菌环境下,获得健康草鱼中后段肠道之后对所述肠道做预处理,所述预处理的操作为:将所述肠道外脂肪与肠系膜除去,纵向剖开肠管并清除粪便,之后刮除肠道黏液以及上皮细胞层,最后用PBS缓冲液振荡清洗,得到肠壁明显变薄且肠壁颜色变为淡黄色至白色的肠段;S2、将所述肠段充分处理成碎块,并加入到胶原酶IV消化液中进行振荡消化,消化结束后过滤得到滤液,将所述滤液进行离心处理获得细胞沉淀物,将所述细胞沉淀物配制成肠黏膜固有层单细胞悬液;S3、从所述肠黏膜固有层单细胞悬液中分离得到肠巨噬细胞;所述步骤S1中健康草鱼中后段肠道的获取操作为:用自来水冲洗健康草鱼的体表后敲打草鱼头部致死,立即放入75%乙醇中浸泡20s,取出肠道中后段;所述预处理在含有预冷的PBS缓冲液的培养皿中进行,肠段用PBS缓冲液振荡清洗3次,所述PBS缓冲液的浓度0.01mol/L,pH7.4;所述步骤S1中,采用无菌弯头镊子刮除肠黏液与上皮细胞层;所述步骤S2中碎块的体积<1mm3,所述碎块置于胶原酶IV消化液中放入28℃振荡培养箱振荡消化2h,所述振荡培养箱的转速为250转/分钟;消化结束将所述胶原酶IV消化液过400目筛网获得滤液,之后将所述滤液以1800rpm离心8min并收集细胞沉淀物,使用Hank's平衡液洗涤所述细胞沉淀物,并使用所述Hank's平衡液将所述细胞沉淀物配成浓度为1×108个/mL的肠黏膜固有层单细胞悬液;所述的胶原酶IV消化液由Hank’s平衡液、胎牛血清以及胶原酶IV组成,所述胎牛血清在胶原酶IV消化液中的质量浓度为1.7mg/mL,所述Hank’s平衡液在胶原酶IV消化液中的体积百分数为95%,所述胎牛血清在胶原酶IV消化液中的体积百分数为5%;步骤S3具体为:在15mL离心管中依次缓慢加入3mL分离液1,2mL分离液2,制成梯度界面;吸取5mL上述制好的单细胞悬液加在分离液液面上,1800rpm/min离心30min,此时离心管内容物被分为五层,由上而下依次是稀释液层、环状乳白色上层、环状乳白色下层、分离液层和红细胞层;用巴氏吸管小心吸取环状乳白色上层至另一15mL离心管中,用Hank's平衡液洗3次,1800rpm/min离心8min,弃上清,用1mL RPMI 1640基础培养液培养液重悬细胞沉淀;所述RPMI 1640基础培养液由RPMI 1640培养液、胎牛血清以及抗微生物液组成,所述RPMI 1640培养液、胎牛血清以及抗微生物液在RPMI 1640基础培养液中的体积百分数分别为94%、5%、1%。
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- 本发明涉及一种通过以下步骤从富血小板血浆(PRP)制备血小板裂解物的方法(i)将富血小板血浆浸入液氮中,(ii)在37℃将所述富血小板血浆解冻,和(iii)随后再重复步骤(i)和(ii)3次。
- 十二烷基癸烯酸BDSF在提升RAW264.7巨噬细胞吞噬能力中的应用-201510148058.5
- 汪联辉;翁丽星;伍开翔 - 南京邮电大学
- 2015-03-31 - 2017-11-14 - C12N5/0786
- 本发明涉及十二烷基癸烯酸BDSF在提升RAW264.7巨噬细胞吞噬能力中的应用,属于生物药品技术领域技术领域。加入BDSF的浓度为3~300μmol/L时可以提升RAW264.7巨噬细胞吞噬C.albicans的能力,BDSF提升RAW264.7巨噬细胞吞噬C.Albicans的作用时间为2h,3h,4h,5h,6h。BDSF具有低生物毒性,且对免疫细胞RAW264.7巨噬细胞吞噬能力的提升有显著效果。
- 一种获得调节性巨噬细胞的新方法-201310345011.9
- 王庆阳;张纪岩;王小茜;肖鹤;张雪莹;黎燕;沈倍奋 - 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所
- 2013-08-09 - 2017-11-14 - C12N5/0786
- 本发明属于生物医学领域,公开了一种体外获得调节性巨噬细胞的方法。涉及使用脾脏内皮基质细胞诱导一种新的调节性巨噬细胞的方法。具体而言,本发明所述的方法材料包括小鼠脾脏基质内皮细胞和骨髓单个核细胞。将两者共培养可以使骨髓单个核细胞分化为巨噬细胞,表达巨噬细胞表面分子标志,以高表达CD45RB,中等表达CD11c为特征,并且该细胞具有类似于M2b性巨噬细胞的细胞因子表达谱。依赖于与ESSC接触培养,该巨噬细胞能够分泌高水平IL‑10,并且在体外抑制T细胞增殖和诱导T细胞凋亡,说明该方法所分选的巨噬细胞经过实验证实呈现调节性巨噬细胞的特点。该方法为体外大量诱导获得高分泌IL‑10的巨噬细胞提供了新的方法,可以应用于实验和临床。
- 过氧化氢诱导的猪肺泡巨噬细胞系氧化应激模型的建立方法-201610909565.0
- 胡庭俊;郝祝兵;李春节;韦英益;尹丹;杨剑;谭红连 - 广西大学
- 2016-10-17 - 2017-04-19 - C12N5/0786
- 本发明公开了一种过氧化氢诱导的猪肺泡巨噬细胞系氧化应激模型的建立方法,采用过氧化氢体外诱导处理猪肺泡巨噬细胞系,过氧化氢浓度为10‑350μM。与现有技术相比,本发明首次使用猪肺泡巨噬细胞系作为过氧化氢诱导氧化应激模型的造模细胞,通过考察细胞死亡率和细胞内ROS水平确定了H2O2溶液的最佳使用浓度和细胞孵育时间,操作容易、成本较低,可帮助初次进行猪肺泡巨噬细胞系培养和氧化应激模型的研究人员比较顺利的完成猪肺泡巨噬细胞系的培养和氧化应激模型的建立。
- 一种永生化罗非鱼巨噬细胞系的建立及鉴定方法-201611040236.3
- 罗洪林;甘西;张永德;陈晓汉;林勇;苏乾莲 - 广西壮族自治区水产科学研究院
- 2016-11-11 - 2017-03-22 - C12N5/0786
- 本发明公开一种永生化罗非鱼巨噬细胞系的建立及鉴定方法,属于细胞生物学技术领域。本发明在分离纯化罗非鱼腹腔巨噬细胞的基础上,利用EBV病毒感染巨噬细胞,通过筛选单克隆细胞的方法,经传代稳定性、体外增殖、端粒酶活性、核型及特异性基因检测等实验鉴定,获得了能连续传代且功能确切的永生化罗非鱼巨噬细胞系。本发明永生化罗非鱼巨噬细胞系为开展病原特性及其致病机理研究、疫苗研制以及功能基因研究等相关领域的理论与应用研究提供了便利。
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