[发明专利]一种用于检测胶基型嚼烟对细胞炎症因子分泌影响的方法

摘要

本发明涉及一种用于检测胶基型嚼烟对细胞炎症因子分泌影响的方法，属于烟草及烟草制品安全性生物学评价技术领域。该方法包括样品前处理、单细胞悬液的制备、单细胞悬浮液的细胞浓度计算、细胞接种、受试物暴露、收集上清、标准溶液配制、加样、加入抗体、加酶结合液、显色、显色终止、测量吸光值和细胞因子分泌量测定灯步骤。本发明综合考察胶基型嚼烟的溶出方式、暴露途径，建立了胶基型嚼烟样品前处理方法，对样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确有效的检测胶基型嚼烟对细胞炎症因子分泌影响。 1

主权项

1.一种用于检测胶基型嚼烟对细胞炎症因子分泌影响的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤（1），样品前处理：将胶基型嚼烟制品加入到37℃的口腔角质细胞培养基中，胶基型嚼烟制品的质量与口腔角质细胞培养基的体积比为1g：10mL；之后于37℃下研磨10min，之后过滤，向滤液中加入血清，使得血清的最终体积百分浓度为10%，得到待测液；

步骤（2），单细胞悬液的制备：将人口腔角质细胞HOK于37℃、5%CO₂培养箱中采用口腔角质细胞培养基培养，待细胞汇合率为80～90%时移除培养基，用pH值为7.2的磷酸缓冲液洗两次，弃洗液；加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液进行单层孵育1～2min，每25cm²生长面积的细胞需要加入浓度为0.25%（w/v）的胰蛋白酶溶液1～2mL，单层孵育后再加入口腔角质细胞培养基将细胞悬起，得到单细胞悬浮液；

步骤（3），单细胞悬浮液的细胞浓度计算：用血球计数板计数法对步骤（2）所得单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升单细胞悬浮液的活细胞数；

步骤（4），细胞接种：将步骤（3）计数后的单细胞悬浮液用口腔角质细胞培养基稀释至2.0×10⁵个/mL，再按接种量为1mL/孔接种到细胞培养板中，之后将细胞培养板置于37℃、5%CO₂培养箱内培养24h；

步骤（5），受试物暴露：受试物分为两组：细胞对照组和样品测试组；移除步骤（4）中细胞培养板内的培养基，再按上述方法进行分组；在细胞对照组相应的孔内加入口腔角质细胞培养基；在样品测试组相应的孔内加入口腔角质细胞培养基和步骤（1）所得待测液，至待测液的体积百分浓度分别为10%、20%、30%、40%、50%；细胞对照组和样品测试组的终体积为1000μl/孔；

步骤（6），收集上清：吸取步骤（5）细胞板上每孔中的培养液，分别离心，取上清；

步骤（7），标准溶液配制：梯度稀释法配制炎症因子的标准曲线溶液，各八个梯度溶液，得到不同浓度的标准溶液；

步骤（8），加样：将步骤（7）得到的不同浓度的标准溶液和步骤（6）每孔得到的上清分别加入酶标板不同的孔中，同时在酶标板上设置空白对照孔并在空白对照孔中加PBS磷酸盐缓冲液；所有孔的加入量均为100ul，之后酶标板覆膜，于37℃下，孵育90分钟；

步骤（9），加抗孵育：加样孵育完成后，取出酶标板，弃液，甩干，每孔加入抗体工作液100ul，之后酶标板覆膜，37℃，孵育60分钟；

步骤（10），洗板和加酶孵育：加抗孵育完成后，取出酶标板，弃液，甩干，加入清洗液350ul/孔，浸泡2分钟，弃液，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干；重复洗板3次；然后在每孔中加酶结合工作液100ul，之后酶标板覆膜，37℃孵育30分钟；

步骤（11），洗板和显色：加酶孵育完成后，取出酶标板，弃液，甩干，加入清洗液350ul/孔，浸泡2分钟，弃液，甩干，并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干；重复洗板5次；然后在每孔中加底物工作液90ul，酶标板覆膜，37℃孵育，30min后加入终止液50ul/孔；

步骤（12），测量吸光值：于酶标仪450nm下检测吸光度；

步骤（13），细胞因子分泌量测定：将每个浓度的标准溶液的吸光度值减去空白对照孔的吸光度值，作为每个浓度的标准溶液的校正吸光度值；之后，根据标准溶液的浓度及其校正吸光度值绘制标准曲线，然后根据标准曲线及样品测试组吸光度值、细胞对照组的吸光度值，计算样品测试组和细胞对照组的细胞因子分泌量；

之后，将样品测试组的细胞因子分泌量与细胞对照组的细胞因子分泌量相比，如有显著差异，且样品测试组的剂量与样品测试组的细胞因子分泌量相比，有剂量反应关系的，即为阳性结果，该胶基型嚼烟会影响细胞炎症因子分泌量；

将样品测试组的细胞因子分泌量与细胞对照组的细胞因子分泌量相比，如无显著差异，则为阴性结果，该胶基型嚼烟对细胞不影响细胞炎症因子分泌量。

2.根据权利要求1所述的用于用于检测胶基型嚼烟对细胞炎症因子分泌量影响的方法，其特征在于，步骤（1）所述的研磨方式具体为：研磨棒顺时针研磨1min后逆时针研磨1min，交替进行，研磨速度为30rpm/min。

3.根据权利要求1所述的用于检测胶基型嚼烟对细胞炎症因子分泌量影响的方法，其特征在于，步骤（1）所述的过滤方法为先用定性滤纸进行初滤，再用0.45μm有机滤膜过滤。

4.根据权利要求1所述的用于检测胶基型嚼烟对细胞炎症因子分泌量影响的方法，其特征在于，步骤（4）所述的细胞培养板为12孔细胞培养板。

5.根据权利要求1所述的用于检测胶基型嚼烟对细胞炎症因子分泌量影响的方法，其特征在于，步骤（5）分组时，样品测试组的各个浓度和细胞对照组均设置3个复孔。

6.根据权利要求1所述的用于检测胶基型嚼烟对细胞炎症因子分泌量影响的方法，其特征在于，步骤（6）中所述的离心速度为1000rpm，时间为20min。

7.根据权利要求1所述的用于检测胶基型嚼烟对细胞炎症因子分泌量影响的方法，其特征在于，所述的酶标板为96孔酶标板。