[发明专利]新疆多浪羊不同生理时期卵巢基因的筛选与鉴定方法

摘要

本发明公开了一种新疆多浪羊不同生理时期卵巢基因的筛选与鉴定方法，属于生物技术领域，该方法包括以下步骤：步骤1、新疆多浪羊不同生理时期卵巢的获得；步骤2、RNA提取；步骤3、文库构建及高通量测序；步骤4、数据处理及生物信息学分析。本发明通过高通量测序，共鉴定基因28717个，其中新候选基因987个，发情期与发情间期相比差异基因308个。

主权项

1.一种新疆多浪羊不同生理时期卵巢基因的筛选与鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、新疆多浪羊不同生理时期卵巢的获得：通过同期发情、发情鉴定和妊娠鉴定技术，将发情间期、发情期和妊娠期多浪羊屠宰后立即取出卵巢，并用无RNA酶水冲洗组织表面，之后迅速投入液氮进行快速冷冻，并带回实验室‑80℃保存备用；步骤2、RNA提取：分别取发情间期、发情期和妊娠期多浪羊卵巢取0.1g，用trizol法提取RNA，该实验用到的所有物品包括1000mL、200μL、10μL tip头、枪头盒、Enpendoff管必须用0.1％的DEPC水或无RNA酶水浸泡6h以上或直接过夜，包装好后高压灭菌20‑30min，65℃烘干备用；用到的所有研钵、玻璃器皿、金属器械用锡箔纸包装好后放于180℃烘箱中烘烤8h以上，自然降温备用，提取的总RNA经微量分光光度计检查纯度及浓度，合适以后送北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行高通量测序；步骤3、文库构建及高通量测序样品检测合格后，用带有Oligo的磁珠，通过A‑T互补配对与mRNA的ployA尾结合的方式富集真核生物的mRNA；随后加入fragmentation buffer将mRNA打断成短片段，以mRNA为模板，用六碱基随机引物random hexamers合成一链cDNA，然后加入缓冲液、dNTPs和DNA polymerase I合成二链cDNA，随后利用AMPure XP beads纯化双链cDNA；纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头，然后用AMPure XP beads进行片段大小选择，最后进行PCR富集得到最终的cDNA文库；文库构建完成后，先使用Qubit2.0进行初步定量，稀释文库至1ng/ul，随后使用Agilent 2100对文库的插入片段长度进行检测，insert size符合预期后，使用Q‑PCR方法对文库的有效浓度进行准确定量，文库有效浓度＞2nM，以保证文库质量；库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行HiSeq测序；步骤4、数据处理及生物信息学分析测序得到的原始测序序列，里面含有带接头的、低质量的reads，为了保证信息分析质量，必须对raw reads进行过滤，得到clean reads，后续分析都基于clean reads。