[发明专利]鼠源性抗人CD36单克隆抗体131-G1（G2a）和176-B8（G1）

摘要

本发明涉及鼠源性抗人CD36单克隆抗体131‑G1（G2a）和176‑B8（G1）的制备方法，属于基因工程技术领域；具体的单克隆抗体制备过程包括CD36基因敲除小鼠基因型鉴定、人血小板cDNA的PCR扩增、TA克隆及蓝白斑筛选、细胞转染及G418筛选、流式鉴定、Western Blot鉴定、CD36基因敲除小鼠免疫、细胞融合及抗体制备、抗人CD36单克隆抗体鉴定、单抗纯化十个步骤；该方法可获得可稳定分泌鼠源性抗人CD36 mAb的杂交瘤细胞株，该mAb可特异性结合人血小板的CD36抗原，可用于人群中CD36抗原表达的检测。

主权项

1.鼠源性抗人CD36单克隆抗体131‑G1：G2a和176‑B8：G1的制备方法，其特征在于：该制备方法包括如下步骤：鼠源性抗人CD36单克隆抗体的制备过程如下：（1）CD36基因敲除小鼠基因型鉴定：根据The Jackson Laboratory提供的信息，合成CD36基因敲除小鼠鉴定的引物，上游引物为：5’‑ TTGAAGTGCTGATCCTTTCAGA‑3’，下游引物为5’‑ TGTTTGTTTCACCACACTGGA‑3’，下游突变引物为5’‑ CGCCTTCTTGACGAGTTC‑3’，经94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸5min，获得435bp长度的野生型和/或750bp长度的突变型小鼠CD36基因序列；（2）人血小板cDNA 的PCR 扩增:根据GenBank 中编码人CD36 的cDNA 序列(NM_000072.3)设计特异性引物，上游引物为:5’‑GGTGCTTAACACTAATTCACCTCC‑3’，下游引物为:5’‑TTTTATTGTTTTCGATCTGCATGC‑3’，经95℃变性30 s，54℃退火50 s，72℃ 延伸2 min， 共35 个循环， 最后72℃ 延伸10 min，获得1452 bp 长度的人CD36 基因序列；（3）TA 克隆及蓝白斑筛选:CD36 基因序列经胶纯化后，参照PcDNA3. 1TM /V5‑His TOPO® TA Expression Kit 操作说明进行TA 克隆，并转化TOP10 E.coli，经蓝白筛选获得阳性质粒，37℃摇菌16 h 后，提取质粒DNA 进行测序分析；（4）细胞转染及G418 筛选:获得序列与人CD36 参考序列一致的质粒DNA 后，参照Effectene® Transfection试剂盒的操作说明转染HEK293T 细胞，并采用G418 进行筛选培养；（5）流式鉴定: 收集人血小板CD36 转染的HEK293T 细胞2. 5 ×105 个细胞，分别于20 μl CD36 阳性血清或0. 05 μg CD36 单克隆抗体FA6‑152 于4℃孵育30 min，洗涤2 遍后，加入FITC 标记的兔抗人IgG 抗体，按照体积比1：50，用PBS进行稀释，4℃ 避光孵育30 min，洗涤2 遍后上流式机分析；（6）Western blot 鉴定:CD36 转染细胞的裂解液经SDS‑PAGE 电泳后，转PVDF 膜，与抗V5 肽单克隆抗体反应，按照体积比1：2000，用PBS进行稀释，然后加入HRP 标记驴抗鼠IgG 抗体，ECL 曝光显影，具体操作参照《分子克隆实验指南》；（7）CD36基因敲除小鼠抗原免疫：采用0.5X10⁷个转染人CD36HEK293T转染细胞对CD36‑/‑小鼠进行腹腔免疫，每周一次，免疫三次后，尾静脉注射等量转染细胞加强免疫，三天后检测小鼠尾静脉血清抗体效价，并备细胞融合使用；（8）细胞融合及抗体制备：摘取抗体效价高的已免疫CD36‑/‑雌鼠的脾脏，将脾细胞与SP2/0‑Ag14细胞在PEG作用下进行细胞融合，采用HAT培养液进行筛选培养；采用流式细胞技术对杂交瘤细胞培养上清进行抗人CD36抗体检测，筛选可分泌IgG型抗人CD36抗体的杂交瘤细胞，经两次有限稀释培养，获得分泌单抗的杂交瘤细胞株；（9）抗人CD36单克隆抗体鉴定：以流式细胞术进行单抗滴度及特异性分析；并运用 Rapid Antibody Isotyping 试剂进行单克隆抗体亚型鉴定。