[发明专利]利用红豆杉形成层干细胞生产紫杉醇的方法在审
| 申请号： | 201811230787.5 | 申请日： | 2018-10-22 |
| 公开（公告）号： | CN109321511A | 公开（公告）日： | 2019-02-12 |
| 发明（设计）人： | 覃家日 | 申请（专利权）人： | 覃家日 |
| 主分类号： | C12N5/04 | 分类号： | C12N5/04;C12P17/02 |
| 代理公司： | 北京远大卓悦知识产权代理事务所(普通合伙) 11369 | 代理人： | 靳浩 |
| 地址： | 546500 广西壮*** | 国省代码： | 广西;45 |
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| 摘要： | 本发明提供一种利用红豆杉形成层干细胞生产紫杉醇的方法，包括以下步骤：1)建立稳定的红豆杉形成层干细胞培养体系；2)往悬浮培养的培养基中添加红豆杉内生真菌提取液，接种红豆杉细胞，人工光照条件下进行通气培养6‑8天，向液体悬浮培养基中加入茉莉酸甲酯和忧遁草提取物继续培养；3)收集红豆杉细胞，进行紫杉醇的粗提取；4)对粗提取物进行纯化；5)往所述浸膏II添加四氢呋喃‑丙酮混合液加热溶解，冷切至室温，自然结晶，晶体再次溶解到四氢呋喃‑丙酮混合液进行重结晶2‑3次，获得高纯度的紫杉醇。本发明具有诱导成功率高、单位细胞紫杉醇含量高等特点。 | ||
| 搜索关键词： | 紫杉醇 红豆杉 红豆杉细胞 四氢呋喃 干细胞 丙酮 溶解 液体悬浮培养基 干细胞培养 混合液加热 茉莉酸甲酯 粗提取物 单位细胞 内生真菌 人工光照 通气培养 悬浮培养 自然结晶 培养基 粗提取 高纯度 混合液 提取物 提取液 重结晶 冷切 成功率 接种 诱导 生产 | ||
【主权项】：
1.一种利用红豆杉形成层干细胞生产紫杉醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)选用红豆杉的嫩茎上的芽体作为培养材料，经洗洁精和自来水洗净，置流水下冲洗10‑30分钟后，置于75％酒精中处理10‑30秒，然后再经0.1％的升汞消毒后用无菌水冲洗，切去外植体变色的部分，然后进行诱导培养，选取连续继代3～5次且生长旺盛、质地疏松、状态稳定均一的新鲜胚性愈伤组织接种到液体悬浮培养基中，震荡培养，每7‑8天继代一次，经2‑3个月的继代培养建立稳定生长的红豆杉形成层干细胞培养体系；2)往悬浮培养的培养基中添加红豆杉内生真菌提取液，混合均匀，获得混合培养液，将混合培养液置于生物反应器中，选取生长速率达9.0～12.0mg/g·d的红豆杉形成层干细胞培养体系，按接种率不小于10％的接种量接种到生物反应器中进行悬浮培养，培养温度为24℃‑26℃，人工光照条件下进行通气培养6‑8天，向液体悬浮培养基中加入茉莉酸甲酯和忧遁草提取物继续培养以诱导红豆杉形成层细胞累积产生紫杉醇；3)收集经步骤2)悬浮培养的培养物，使用磷酸缓冲溶液进行洗涤3‑5次后进行冷冻干燥，得到冻干粉，往所述冻干粉末中添加去离子水，水浴加热浸泡所述冻干粉，离心过滤，滤渣加水反复浸泡2‑3次，合并滤液，用乙酸乙酯进行搅拌萃取，静置，待分层后收集水相，水相重复用乙酸乙酯萃取2‑3次，收集水相，添加乙醇溶液低温减压浓缩得浸膏I；4)将所述浸膏I用适量无水乙醇溶解后，形成粗提液，加入与无水乙醇相同体积的丙酮，静置沉降10‑11h，过滤，在滤液中添加活性炭颗粒，置于43‑46℃的条件下进行脱色处理，过滤，往滤液中添加大孔树脂吸附，然后用不同浓度的乙醇进行梯度洗脱，合并洗脱液后低温减压浓缩得浸膏II；5)往所述浸膏II添加四氢呋喃‑丙酮混合液加热溶解，冷切至室温，自然结晶，晶体再次溶解到四氢呋喃‑丙酮混合液进行重结晶2‑3次，获得高纯度的紫杉醇。
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- 贾瑞冬;葛红;李秋香;张晓;周妍慧;徐玉凤;刘娜;王洪云 - 中国农业科学院蔬菜花卉研究所
- 2017-02-27 - 2019-08-02 - C12N5/04
- 本发明提供了一种带叶兜兰组织培养快速繁殖的方法，包括以下步骤：(1)自交授粉；(2)果荚采摘；(3)无菌播种；(4)增殖继代培养；(5)生根壮苗培养；(6)生根苗移栽。本发明还提供了一种适于带叶兜兰组织培养快速繁殖的培养基体系，包括萌发培养基、增殖培养基和生根壮苗培养基，其可用于上述带叶兜兰组培快繁方法中。本发明另外还提供了带叶兜兰果荚的最佳采摘期，即在带叶兜兰自交后120‑195天左右采摘果荚。通过本发明的方法培养的种苗萌发率高、健壮、根系发达、生长周期短，同时，本发明的方法简单易操作，生产成本低，为带叶兜兰商业化生产提供了很好的基础。
- 促进土党参离体增殖的套盒和方法-201611219707.7
- 胡秀;冯敏;许炳强;梁韩枝;其他发明人请求不公开姓名 - 中国科学院华南植物园
- 2016-12-26 - 2019-07-30 - C12N5/04
- 本发明公开了一种促进土党参离体增殖的套盒，套盒包含用以诱导出带不定芽块的茎段的培养基1和用以反复继代培养培养基2，培养基1和培养基2均包含以下组分：6‑苄基氨基嘌呤、噻苯隆和MS培养液；同时，本发明公开了一种促进土党参离体增殖的方法。采用本发明的套盒和方法，解决了采用NAA和BA配比进行繁殖的过程中，繁殖苗细弱、枯黄、死亡以及繁殖率低的问题；以30天为培养周期，利用本发明的套盒可以使土党参的繁殖倍率达到10‑15倍，并获得健壮无菌苗，生根率和移栽成活率均为100％。
- 一种用于提取柑橘果肉有色体中的质体小球的方法-201610845699.0
- 邓秀新;刘云;曾云流;谢宗周 - 华中农业大学
- 2016-09-20 - 2019-07-30 - C12N5/04
- 本发明涉及一种用于提取柑橘果肉有色体中的质体小球的方法，其包括以下步骤：S1：从柑橘果肉中提取有色体；S2：超声破碎所述有色体，得到有色体裂解液；S3：使用含有碘海醇浓度梯度的系列溶液对所述有色体裂解液于150000g下梯度离心，分层后的上层液体即为质体小球。通过使用本发明的方法可有效地从柑橘果肉中提取有色体质体小球，分层效果明显，所得到的质体小球的纯度高，提纯效果好，并且保持了质体小球中的蛋白质在种类和结构上的完整性。
- 一种小麦完整叶绿体的制备方法-201610414277.8
- 王小纯;张浩然;韦一昊;熊淑萍;马新明 - 河南农业大学
- 2016-06-15 - 2019-07-26 - C12N5/04
- 本发明属于生物技术领域，涉及植物完整细胞器分离纯化技术领域，具体涉及一种简便快捷的小麦完整叶绿体的制备方法。步骤如下：（1）制备Percoll梯度；（2）小麦样品的预处理；（3）小麦样品的密度梯度离心；（4）完整叶绿体的提取。本发明以Percoll为介质进行梯度离心，不仅可以区分小麦完整及破损叶绿体，而且制备时间短，程序简便，获得充足的完整的叶绿体，进行定量测定后，可以精确的运用于叶绿体功能、膜蛋白、基质蛋白及叶绿体DNA的提取及各种后续研究。
- 一种结球甘蓝花粉诱导培养基配方-201610876021.9
- 谭兴江;张瑞明;宋兆霞 - 安徽新源农业科技有限公司
- 2016-10-08 - 2019-07-12 - C12N5/04
- 本发明提供了一种结球甘蓝花粉诱导培养基，其配方含有KNO3、MgSO4∙7H2O、KH2PO4、Ca(NO3)2∙4H2O、Na2‑EDTA、FeSO4∙7H2O、MnSO4∙4H2O、AgNO3、H3BO3、ZnSO4∙7H2O、KI、Na2MoO4∙2H2O、CuSO4∙5H2O、CoCl2∙6H2O、L‑谷氨酰胺、N‑乙酰基‑5‑甲氧基色胺、维生素B1、维生素B6、2‑吗啉乙磺酸、烟酸、叶酸、生物素、肌醇、山梨醇、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、阿拉伯半乳聚糖、甲基亚硝基脲、蔗糖、植物凝胶、6‑BA、胰岛素、水解蛋白和活性炭。该培养基可以大大提高结球甘蓝花粉胚性愈伤诱导效率，具有重要应用价值。
- 一种大花红景天的离体培养联合用培养基及离体培养方法-201710671226.8
- 任东升;鲁有均;王涛;邓强 - 西藏诺迪康药业股份有限公司
- 2017-08-08 - 2019-07-12 - C12N5/04
- 本发明提供了一种大花红景天的离体培养联合用培养基，它包括愈伤组织诱导培养基、愈伤组织继代培养基、芽分化培养基、芽增殖培养基和生根培养基。本发明还提供一种大花红景天的离体培养方法。本发明的联合用培养基及离体培养方法，能够用于大花红景天高效离体再生，应用前景良好。
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