[发明专利]一种利用基因编辑技术提高禽蛋溶菌酶产量的方法在审
| 申请号： | 201910086730.0 | 申请日： | 2019-01-29 |
| 公开（公告）号： | CN109735519A | 公开（公告）日： | 2019-05-10 |
| 发明（设计）人： | 任晋东;卢立志;刘小林;俞奇力;刘雅丽;付永前;王文基;沈建良;杨福生 | 申请（专利权）人： | 台州学院;浙江省农业科学院;西北农林科技大学 |
| 主分类号： | C12N9/36 | 分类号： | C12N9/36;C12N15/85;C12N15/88 |
| 代理公司： | 北京汇捷知识产权代理事务所(普通合伙) 11531 | 代理人： | 李宏伟 |
| 地址： | 318000 浙江*** | 国省代码： | 浙江;33 |
| 权利要求书： | 查看更多 | 说明书： | 查看更多 |
| 摘要： | 本发明公开了一种利用基因编辑技术提高禽蛋溶菌酶产量的方法，该方法包括以下步骤：将包含有针对禽溶菌酶启动子区域进行定点编辑的靶向sgRNA克隆到包含DNA双链剪切的Cas9基因的V2质粒中，得到针对禽溶菌酶启动子进行编辑的质粒；构建基因编辑模板ssDNA，该模板ssDNA为包含靶点互补链左侧同源序列、2000bp卵清蛋白转录启动互补序列以及靶点互补链右侧同源序列的线状ssDNA；将上述基因编辑质粒、基因编辑模板ssDNA混合制成质粒载体组混合液，并将混合液与脂质体混合抚育、注射到囊胚附近孵化，获得含有高效启动子的溶菌酶基因的雌性家禽个体。本发明方法具有技术可靠，永久及安全高效表达的特点，溶菌酶的翻译量提高了近百倍。 | ||
| 搜索关键词： | 溶菌酶 质粒 基因 利用基因 同源序列 互补链 混合液 启动子 靶点 禽蛋 启动子区域 溶菌酶基因 脂质体混合 转录 雌性家禽 高效表达 互补序列 卵清蛋白 质粒载体 剪切 靶向 构建 囊胚 线状 抚育 注射 克隆 孵化 翻译 安全 | ||
【主权项】：
1.一种利用基因编辑技术提高禽蛋溶菌酶产量的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)将包含有针对禽溶菌酶启动子区域进行定点编辑的靶向sgRNA克隆到包含DNA双链剪切的Cas9基因的V2质粒中，得到针对禽溶菌酶启动子进行编辑的质粒；(2)构建基因编辑模板ssDNA，该模板ssDNA为包含靶点互补链左侧同源序列、2000bp卵清蛋白转录启动互补序列以及靶点互补链右侧同源序列的线状ssDNA；(3)将上述基因编辑质粒、基因编辑模板ssDNA混合制成质粒载体组混合液，并将混合液与脂质体混合抚育；(4)在体外孵化禽胚蛋的胚盘附近加入脂质体抚育后，把步骤(3)中抚育后的混合液注射到开始发育的囊胚附近，将整个胚蛋移至体外容器，加入双抗后用密封、孵化，在形成个体后对插入的片段进行验证筛选，获得含有高效启动子的溶菌酶基因的雌性家禽个体。
下载完整专利技术内容需要扣除积分，VIP会员可以免费下载。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于台州学院;浙江省农业科学院;西北农林科技大学，未经台州学院;浙江省农业科学院;西北农林科技大学许可，擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作，请联系【客服】
本文链接：http://www.vipzhuanli.com/patent/201910086730.0/，转载请声明来源钻瓜专利网。
- 同类专利
- 一种溶菌酶的高效生产方法-201910772182.7
- 宋凯;陈文武;吴江涛 - 徐州生物工程职业技术学院
- 2019-08-21 - 2019-11-12 - C12N9/36
- 本发明公开的属于溶菌酶技术领域，具体为一种溶菌酶的高效生产方法，该溶菌酶的高效生产方法步骤如下：步骤一：原料处理：将鸡蛋利用蛋清分离器分离出蛋清，然后将蛋清搅拌5分钟，使鸡蛋清的粘稠度均匀，接着利用筒筛过滤除去脐带块等其他杂质；步骤二：吸附：利用搅拌装置边搅拌蛋清边加入724树脂，使724树脂全部悬浮于蛋清中，温度控制在0‑5摄氏度，搅拌吸附3‑6小时，将蛋清在0‑5摄氏度环境中静置过夜；步骤三：去杂蛋白：将步骤二处理后的蛋清，把上层清液渐渐倒出，下层树脂用清水洗去吸附的蛋白质，反复清洗3‑5次，将树脂抽滤掉水分；该发明提高了溶菌酶的纯度，简化了生产过程，提高了生产效率的综合效果。
- 一种巯基蛋白酶的提取方法-201610068612.3
- 蓝平;廖安平;何日梅;蓝丽红;张金彦;李媚;孙锦;周烈;周珍珍 - 广西民族大学
- 2016-02-01 - 2019-10-11 - C12N9/36
- 本发明公开了一种巯基蛋白酶的提取方法。所述的提取方法包括以下步骤：(1)将木薯淀粉磁性微球，与含有巯基蛋白酶的溶液混合后进行振荡吸附；(2)将步骤(1)的反应液进行磁性分离后，将木薯淀粉磁性微球进行洗脱，即可。本发明的分离方法操作简单，时间短，设备要求简单，且平衡吸附量较高。
- 一种利用短脂肪链槐糖脂衍生物共价修饰的溶菌酶及其修饰方法和应用-201610485378.4
- 石玉刚;陆海霞;陆旭阳;卞立晴;卢腾;蔡文强;吴煜;孙锦程 - 浙江工商大学
- 2016-06-23 - 2019-09-20 - C12N9/36
- 本发明公开了一种利用羧酸型短脂肪链槐糖脂衍生物共价修饰的溶菌酶及其修饰方法和应用，该修饰方法包括以下步骤：(1)将槐糖脂衍生物的活性酯溶解在DMSO，然后加入溶菌酶的NaHCO3水溶液，搅拌条件下进行缩合反应，反应结束后得到反应混合物；所述的槐糖脂衍生物为羧酸型短脂肪链槐糖脂衍生物；(2)依次采用去离子水和磷酸盐缓冲液对步骤(1)得到的缓冲液体系进行透析，得到的透析物经过离心分离得到修饰后的溶菌酶。经过修饰的溶菌酶不仅能有效抑制革兰氏阳性菌活性，同时也能显著抑制革兰氏阴性菌活性，从而扩展天然溶菌酶的抑菌谱，可作为多功能食品保鲜剂。
- 一种利用短脂肪链无酰基槐糖脂衍生物共价修饰的溶菌酶及其修饰方法和应用-201610487645.1
- 石玉刚;任月萍;卞立晴;潘莹;巴楚洁;黄欣莹 - 浙江工商大学
- 2016-06-23 - 2019-09-20 - C12N9/36
- 本发明公开了一种利用羧酸型短脂肪链无酰基槐糖脂衍生物共价修饰的溶菌酶及其修饰方法和应用，该修饰方法包括以下步骤：(1)将槐糖脂衍生物的活性酯溶解在DMSO，然后加入溶菌酶的NaHCO3水溶液，搅拌条件下进行缩合反应，反应结束后得到反应混合物；所述的槐糖脂衍生物为羧酸型短脂肪链无酰基槐糖脂衍生物；(2)依次采用去离子水和磷酸盐缓冲液对步骤(1)得到的缓冲液体系进行透析，得到的透析物经过离心分离得到修饰后的溶菌酶。经过修饰的溶菌酶不仅能有效抑制革兰氏阳性菌活性，同时也能显著抑制革兰氏阴性菌活性，从而扩展天然溶菌酶的抑菌谱，可作为多功能食品保鲜剂。
- 一种猪溶菌酶来源的饲用抗菌十二肽及其制备方法-201610369095.3
- 陆健;蔡国林;朱德伟 - 江南大学
- 2016-05-30 - 2019-09-17 - C12N9/36
- 本发明公开了一种猪溶菌酶来源的饲用抗菌十二肽及其制备方法，属于生物工程领域。本发明的制备方法包括了粗提液的制备，凝胶过滤色谱柱Superdex Peptide 10/300GL的分离，和反相柱Phenomenex luna C18分离纯化。经LC‑MS鉴定，该抗菌十二肽的氨基酸序列为：G‑V‑S‑L‑A‑N‑W‑V‑C‑L‑A‑K，此抗菌肽属于碱性肽，对革兰氏阴性菌具有明显抗性，是对猪溶菌酶的抗菌谱的良好补充和拓展。经与抗菌肽数据库(The Antimicrobial Peptide Database)等数据库比对，此种抗菌肽并未见报道。本发明制备工艺具有简单、高效的特点，产物纯度经质谱鉴定可达95％以上。
- 一种通过发酵工艺制备溶菌酶的方法-201710277771.9
- 潘宏涛;卢亚萍 - 浙江艾杰斯生物科技有限公司
- 2017-04-25 - 2019-08-23 - C12N9/36
- 本发明涉及一种通过发酵工艺制备溶菌酶的方法，包括以下步骤：取液体培养基置于三角瓶中，按1‑10％v/v的接种量接入菌体种子，进行摇瓶发酵，发酵条件为20‑40℃，150‑300r/min，发酵培养24h后，将发酵液离心去除菌体，取上清液用硫酸铵盐析法纯化，即得溶菌酶，所述液体培养基包含葡萄糖、蛋白胨和无机盐，所述无机盐为浓度比为1:4‑4:1的MgSO4和ZnCl2混合物。该发酵工艺方法通过优化培养基中无机盐的种类和浓度，获得了较高活性的溶菌酶。
- 一种新型无花果植物来源的溶菌酶及其发酵生产工艺-201910330316.X
- 龚晋慷 - 上海益好纳米科技有限公司
- 2019-04-23 - 2019-08-20 - C12N9/36
- 本发明公开了一种新型无花果植物来源的溶菌酶及其发酵生产工艺，所述溶菌酶包括重组后的表达序列、宿主菌株、表达载体、发酵工艺，所述重组后的表达序列为无花果溶菌酶的N‑端序列1‑129氨基酸，根据蛋清溶菌酶活性位点Glu35和Asp52的位置，通过基因序列改变将无花果溶菌酶的第35和52位置的氨基酸变成谷氨酸和天冬氨酸；所述发酵生产工艺步骤包括表达序列的获取、质粒的提取、设计特性引物、基因的扩增、重组质粒的构建、重组子的鉴定、菌株的构建、植物源重组溶菌酶的高效表达；经过杀菌检测，本方法制备的无花果溶菌酶具有很强的杀菌能力，可应用于抗菌产品领域，如消毒类产品、伤口敷料等。
- 一种人源溶菌酶蛋白纯化方法-201410562496.1
- 江松敏;余龙;余文博;于颖;曹立环;陶建军;唐丽莎;杨鲜梅;赛音 - 复旦大学
- 2014-10-21 - 2019-08-09 - C12N9/36
- 本发明属于蛋白纯化领域，具体而言，本发明涉及一种纯化人源溶菌酶蛋白的方法。本发明还涉及该生产方法的应用。本发明提供了一种人源溶菌酶蛋白纯化方法，该人源溶菌酶蛋白纯化方法包括：发酵液的前处理；Bestarose MMC Diamond捕获；Bestdex G‑25缓冲液置换；浓缩目的蛋白。本发明建立了复合型阳离子交换介质分离纯化发酵液中人源溶菌酶的新工艺，步骤少、成本低，能得到较高的蛋白投入产出比，为人溶菌酶蛋白的工业化生产提供了一个高效的生产工艺。
- 一种利用无酰基槐糖脂衍生物共价修饰的溶菌酶及其修饰方法和应用-201610485255.0
- 石玉刚;任月萍;邵诗音;蔡文强;袁燕微;汪琦;朱陈敏 - 浙江工商大学
- 2016-06-23 - 2019-08-06 - C12N9/36
- 本发明公开了一种利用槐糖脂衍生物共价修饰的溶菌酶及其修饰方法和应用，该修饰方法包括以下步骤：(1)将无酰基槐糖脂衍生物的活性酯溶解在DMSO，然后加入天然溶菌酶的NaHCO3水溶液，搅拌条件下进行缩合反应，反应结束后得到共价修饰混合物；所述的槐糖脂衍生物为羧酸型无酰基槐糖脂；(2)依次采用去离子水和磷酸盐缓冲液对步骤(1)得到的缓冲液体系进行透析，得到的透析物经过离心分离得到共价修饰后的溶菌酶。所得到的溶菌酶不仅能有效抑制革兰氏阳性菌活性，同时也能显著抑制革兰氏阴性菌活性，可作为多功能食品保鲜剂。
- 一种利用槐糖脂衍生物共价修饰的溶菌酶及其修饰方法和应用-201610474289.X
- 石玉刚;房升;邵诗音;汪琦;朱陈敏;孙锦程;洪东升 - 浙江工商大学
- 2016-06-23 - 2019-08-06 - C12N9/36
- 本发明公开了一种利用槐糖脂衍生物共价修饰的溶菌酶及其制备方法和应用，该修饰方法包括以下步骤：(1)将槐糖脂衍生物的N‑羟基琥珀酰亚胺酯溶解在DMSO中，然后加入天然溶菌酶的NaHCO3水溶液，搅拌条件下进行反应，反应结束后得到共价修饰反应混合物；所述的槐糖脂衍生物为羧酸型全酰基槐糖脂；(2)依次采用去离子水和磷酸盐缓冲液对步骤(1)得到的混合液进行透析，得到的透析物经过离心分离得到共价修饰后的溶菌酶。槐糖脂衍生物共价修饰溶菌酶不仅能有效抑制革兰氏阳性菌活性，同时也能显著抑制革兰氏阴性菌活性，从而扩展天然溶菌酶的抑菌谱，可作为多功能食品保鲜剂。
- 一种利用中长脂肪链无酰基槐糖脂衍生物共价修饰的溶菌酶及其修饰方法和应用-201610486842.1
- 石玉刚;任月萍;邵诗音;刘家贵;黄子琪 - 浙江工商大学
- 2016-06-23 - 2019-08-06 - C12N9/36
- 本发明公开了一种利用中长脂肪链无酰基槐糖脂衍生物(DSL‑C12)共价修饰的溶菌酶及其修饰方法和应用，该修饰方法包括以下步骤：(1)将槐糖脂衍生物的活性酯溶解在DMSO，然后加入溶菌酶的NaHCO3水溶液，搅拌条件下进行缩合反应，反应结束后得到反应混合物；所述的槐糖脂衍生物为羧酸型中长脂肪链槐糖脂；(2)依次采用去离子水和磷酸盐缓冲液对步骤(1)得到的混合物进行透析，得到的透析物经过离心分离得到修饰后的溶菌酶。经过修饰的溶菌酶不仅能有效抑制革兰氏阳性菌活性，同时也能显著抑制革兰氏阴性菌活性，从而扩展天然溶菌酶的抑菌谱，可作为多功能食品保鲜剂。
- 一种利用中长脂肪链槐糖脂衍生物共价修饰的溶菌酶及其修饰方法和应用-201610484733.6
- 石玉刚;王贺;任月萍;卞立晴;吴煜;蔡文强;余頔 - 浙江工商大学
- 2016-06-23 - 2019-08-02 - C12N9/36
- 本发明公开了一种利用中长脂肪链槐糖脂衍生物共价修饰的溶菌酶及其修饰方法与应用，该修饰方法包括以下步骤：(1)将槐糖脂衍生物的活性酯溶解在DMSO，然后加入溶菌酶的NaHCO3水溶液，搅拌条件下进行缩合反应，反应结束后得到反应混合物；所述的槐糖脂衍生物为羧酸型中长脂肪链槐糖脂；(2)依次采用去离子水和磷酸盐缓冲液对步骤(1)得到的缓冲液体系进行透析，得到的透析物经过离心分离得到修饰后的溶菌酶。经过修饰的溶菌酶不仅能有效抑制革兰氏阳性菌活性，同时也能显著抑制革兰氏阴性菌活性，从而扩展天然溶菌酶的抑菌谱，可作为多功能食品保鲜剂。
- 具有溶菌酶活性的多肽、编码其的多核苷酸及其用途和组合物-201780074806.7
- 刘晔;M·克劳森;K·M·施诺尔;L·K·斯科乌;S·尼曼德格拉鲁;M·T·科恩;P·B·奥尔森;李明 - 诺维信公司
- 2017-12-21 - 2019-07-30 - C12N9/36
- 公开了包含一种或多种具有溶菌酶活性的多肽的动物饲料或动物饲料添加剂。还提供了具有溶菌酶活性的多肽、编码多肽核酸构建体的多核苷酸、载体和包含这些多核苷酸的宿主细胞以及产生和使用这些多肽的方法。
- 发酵工艺制备溶菌酶的方法-201710277208.1
- 潘宏涛;卢亚萍 - 浙江艾杰斯生物科技有限公司
- 2017-04-25 - 2019-06-21 - C12N9/36
- 本发明涉及发酵工艺制备溶菌酶的方法，包括以下步骤：取液体培养基置于三角瓶中，按1‑10％v/v的接种量接入菌体种子，进行摇瓶发酵，发酵条件为20‑40℃，150‑300r/min，发酵培养24h后，将发酵液离心去除菌体，取上清液用硫酸铵盐析法纯化，即得溶菌酶，所述液体培养基包含葡萄糖、蛋白胨和表面活性剂，所述表面活性剂为浓度比为1:2‑2:1的椰油脂肪酸二乙酰胺和吐温类表面活性剂的混合物。该发酵工艺方法通过优化培养基中表面活性剂的种类和浓度，获得了较高活性的溶菌酶。
- 溶菌酶纳米晶溶胶及采用其制备的蛋白质多晶水凝胶和制备方法-201611065944.2
- 杨鹏;陶菲;韩倩 - 陕西师范大学
- 2016-11-28 - 2019-05-14 - C12N9/36
- 本发明公开了一种溶菌酶纳米晶溶胶及采用其制备的蛋白质多晶水凝胶和制备方法，该溶菌酶纳米晶溶胶是在pH为6.0～6.9、温度为30～50℃下用三(2‑羧乙基)膦还原溶菌酶形成，溶菌酶纳米晶溶胶在氨水作用和加热条件下，溶菌酶纳米片晶自组装形成三维网络结构的蛋白质多晶水凝胶。本发明的蛋白质多晶水凝胶是纯粹的蛋白质水凝胶材料，具有良好的生物相容性和抗菌性，同时由于该水凝胶是由溶菌酶纳米片晶组成，具有各项异性，是一种新型的各相异性软材料和良好的化学软模板。
- 一种利用基因编辑技术提高禽蛋溶菌酶产量的方法-201910086730.0
- 任晋东;卢立志;刘小林;俞奇力;刘雅丽;付永前;王文基;沈建良;杨福生 - 台州学院;浙江省农业科学院;西北农林科技大学
- 2019-01-29 - 2019-05-10 - C12N9/36
- 本发明公开了一种利用基因编辑技术提高禽蛋溶菌酶产量的方法，该方法包括以下步骤：将包含有针对禽溶菌酶启动子区域进行定点编辑的靶向sgRNA克隆到包含DNA双链剪切的Cas9基因的V2质粒中，得到针对禽溶菌酶启动子进行编辑的质粒；构建基因编辑模板ssDNA，该模板ssDNA为包含靶点互补链左侧同源序列、2000bp卵清蛋白转录启动互补序列以及靶点互补链右侧同源序列的线状ssDNA；将上述基因编辑质粒、基因编辑模板ssDNA混合制成质粒载体组混合液，并将混合液与脂质体混合抚育、注射到囊胚附近孵化，获得含有高效启动子的溶菌酶基因的雌性家禽个体。本发明方法具有技术可靠，永久及安全高效表达的特点，溶菌酶的翻译量提高了近百倍。
- 具提升酶活性的溶菌酶-201711026979.X
- 陈纯琪;王韬;黄建文;郭瑞庭 - 成都必高生物科技有限公司
- 2017-10-27 - 2019-05-07 - C12N9/36
- 本发明关于一种具提升酶活性的溶菌酶，其氨基酸序列为将序列编号2第166个位置的组氨酸突变成赖氨酸的序列。本发明提供的溶菌酶的活性明显高于野生型溶菌酶，进而降低了其生产成本并增加了此溶菌酶的工业应用价值。
- 来源于褶纹冠蚌基因的病毒型重组溶菌酶-201811476028.7
- 叶婷;任乾;胡怡琦;李西亚;赵雪芹;费辉;任小元 - 浙江理工大学
- 2018-12-04 - 2019-04-16 - C12N9/36
- 本发明公开了一种来源于褶纹冠蚌基因的病毒型重组溶菌酶，所述重组溶菌酶的编码序列为SEQ ID No.1所示核苷酸序列，所述重组溶菌酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。本发明的重组溶菌酶具有较宽的pH值耐受范围，且对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌均具有抑菌效果，对绿脓杆菌的抑菌效果更明显，具有广泛的应用前景。
- 一种具有增强的抑菌效果的噬菌体裂解酶-201510002678.8
- 任慧英;张灿;王元超;卢国民;孙虎芝;王婷;邹玲;刘文华 - 青岛农业大学
- 2015-01-05 - 2019-04-05 - C12N9/36
- 本发明将裂解酶Bp7e氨基酸的第99位亮氨酸和102位蛋氨酸分别进行突变为丙氨酸和谷氨酸，经原核表达技术得到了突变体蛋白并经Western‑blot对其进行了鉴定，命名为Bp7c突变体蛋白。对Bp7e和Bp7e突变体蛋白进行了纯化及浓度测定，通过体外裂解实验及裂解谱检测得知，纯化的Bp7e和Bp7e突变体两种蛋白具有广谱的抑菌作用，对溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和多种血清型大肠杆菌均有裂解效果，且Bp7e突变体裂解效果整体优于天然裂解酶Bp7e。
- 一种猪溶菌酶来源的饲用抗菌六肽及其制备方法-201610367732.3
- 陆健;蔡国林;朱德伟 - 江南大学
- 2016-05-30 - 2019-04-02 - C12N9/36
- 本发明公开了一种猪溶菌酶来源的饲用抗菌六肽及其制备方法，属于生物工程领域。本发明的制备方法包括了粗提液的制备，凝胶过滤色谱柱Superdux Peptide 10/300GL的分离，和反相柱Phenomenex luna C18分离纯化。经LC‑MS鉴定，该抗菌六肽的氨基酸序列为：A‑W‑V‑A‑W‑K，此抗菌肽属于碱性肽，对革兰氏阴性菌具有明显抗性，是对猪溶菌酶的抗菌谱的良好补充和拓展。经与抗菌肽数据库(TheAntimicrobial Peptide Database)等数据库比对，此种抗菌肽并未见报道。本发明制备工艺具有简单、高效的特点，产物纯度经质谱鉴定可达95％以上。
- 一种来源于三角帆蚌基因的重组溶菌酶-201811330930.8
- 叶婷;任乾;胡怡琦;李西亚;赵雪芹;费辉;任小元 - 浙江理工大学
- 2018-11-09 - 2019-02-19 - C12N9/36
- 本发明公开了一种来源于三角帆蚌基因的重组溶菌酶，所述重组溶菌酶的编码序列为SEQ ID No.1所示核苷酸序列，所述重组溶菌酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。本发明的重组溶菌酶具有较宽的pH值耐受范围，且对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌均具有抑菌效果，对革兰氏阳性菌的抑菌效果更明显，具有广泛的应用前景。
- 一种重组人溶菌酶工业化发酵方法-201710612509.5
- 朱幼惠 - 上海复华兴生物技术有限公司
- 2017-07-25 - 2019-02-01 - C12N9/36
- 本发明属于基因工程和发酵工程领域，涉及一种高密度发酵重组人溶菌酶的生产工艺方法，本发明采用毕赤酵母高密度发酵生产重组人溶菌酶，特别是采用自动控制发酵罐迸行发酵的工艺；本发明将表达人溶菌酶的种子发酵液加入发酵罐进行高密度发酵，所述的高密度发酵包括甲醇诱导和甘油补料；当甘油彻底耗尽，开始甲醇诱导，通过筛选，反复测试并优化高细胞密度发酵的生产工艺，可以使溶菌酶蛋白在发酵罐中的表达水平比普通摇瓶提高10～100倍，完全满足大规模生产的需要。
- 一种人源溶菌酶蛋白LYC8及其生产工艺和应用-201710614035.8
- 朱幼惠 - 上海复华兴生物技术有限公司
- 2017-07-25 - 2019-02-01 - C12N9/36
- 本发明属基因工程领域,涉及生产人溶菌酶的新方法。本发明基于目前市场上的溶菌酶蛋白来源于其他种属动物机体,对人体而言是异种蛋白,有很强的抗原性,副作用大的现状，提供了生产人溶菌酶的新方法，该方法能在酵母中高效表达人体中的溶菌酶蛋白,解决异源性溶菌酶用于人体内的抗原性问题；同时本发明涉及的人源溶菌酶其溶菌酶活性较高,并可使用相对简单的分离纯化步骤。本发明还提供了一种产生具有人溶菌酶蛋白活性的多肽的方法,包括如下步骤:将SEQ ID N0:1所示序列连于表达调控序列,然后转入宿主细胞,筛选出表达人溶菌酶蛋白的重组细胞；随后高密度培养。本发明还涉及上述方法的产物及其应用。
- 一种重组人源溶菌酶的层析方法-201710614064.4
- 朱幼惠 - 上海复华兴生物技术有限公司
- 2017-07-25 - 2019-02-01 - C12N9/36
- 本发明属于生物大分子的分离纯化领域，涉及一种重组人源溶菌酶的层析方法。本发明还包括该层析方法特定的层析介质。基于溶菌酶具有抗菌、消炎、抗病毒等重要作用，本发明利用新型阴离子/疏水复合填料介质，通过对介质平衡液、洗脱液组合方式等介质和方法的优化，直接从酵母菌发酵液中分离纯化重组人源溶菌酶，分离纯化后得到的溶菌酶蛋白纯度和活力分别可以达到99.0％和70000u/mg以上。本发明较现有技术的重组人源溶菌酶的生产方式，具有处理速度快，处理量大，工作量小，成本低的优点，适合工厂化大规模生产。
- 一种重组人溶菌酶工业化纯化工艺-201710614066.3
- 朱幼惠 - 上海复华兴生物技术有限公司
- 2017-07-25 - 2019-02-01 - C12N9/36
- 本发明属基因工程技术领域，涉及一种蛋白纯化工艺，具体涉及一种重组人溶菌酶工业化纯化工艺。本发明中，从含有重组人溶菌酶基因的酵母菌培养液上清中纯化重组人溶菌酶。以颗粒大小为45‑165μm的强阳离子葡聚糖凝胶为介质，通过层析方法分离纯化溶菌酶蛋白，包括装柱、上样、清洗和洗脱的步骤。该方法只用一步离子交换层析，处理80‑120升样品只需要2个工作日，总回收率60％以上，溶菌酶比活大于20000U/mg蛋白，SDS‑PAGE电泳结果纯度达95％。
- 一种抗菌肽混合物及其制备方法和应用-201810146214.8
- 姚云昕 - 浙江艾格生物科技股份有限公司
- 2018-02-12 - 2019-01-29 - C12N9/36
- 本发明公开了一种来源于鸡蛋溶菌酶的抗菌肽混合物及其制备方法和应用，属于分子生物学技术领域。所述抗菌肽混合物的制备方法，包括：利用碱性蛋白酶对鸡蛋溶菌酶进行酶解得到粗提物，经分离纯化，收集具有抗菌活性的纯化产物，获得所述的抗菌肽混合物。本发明利用碱性蛋白酶对鸡蛋溶菌酶进行酶解，其酶解产物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性较鸡蛋溶菌酶的抑菌活性提高了40％，其抗菌活性显著提升，扩大了鸡蛋溶菌酶的应用范围；本发明提供的制备工艺具有简单、快速、高效的特点，适合工业化生产。
- 一种溶菌酶的发酵方法-201811346353.1
- 谢渊;罗漫杰;杨广宇 - 武汉瀚海新酶生物科技有限公司
- 2018-11-13 - 2019-01-18 - C12N9/36
- 本发明公开了一种溶菌酶的发酵方法，步骤一：装柱，阳离子交换树脂CM‑Sephdex用稀缓冲盐水溶液浸泡一昼夜，并不时轻轻搅动使之平衡，在与此溶剂平衡期间，让装柱的CM‑Sephdex材料沉降，用倾泻法除掉悬液中漂浮的小颗粒，然后装柱，注意装柱时不要夹入气泡，柱的大小视加工规模而定；步骤二：收集提取液，收集鸡蛋清，用双层纱布过滤以除去碎蛋壳及胚索后，按其体积的两倍量加入水，小心搅拌使其混合，需要注意的是，涉及溶菌酶发酵技术领域。该溶菌酶的发酵方法，通过结晶经分离、干燥后即为溶菌酶成品，纯度不足，通过重结晶方法进一步纯化，将溶菌酶附属的溶质溶于溶剂后，将溶剂进行吸附后，将溶质进行重结晶便可以纯化。
- 一种利用鸡蛋清生产溶菌酶晶体的方法-201810959893.0
- 雷文彩;左文海;蒋有德 - 雷文彩;雷晋宁;周启真;雷中国
- 2018-08-20 - 2018-12-14 - C12N9/36
- 一种利用鸡蛋清生产溶菌酶晶体的方法，包括1)材料选择与预处理，2)吸附，3)洗脱，4)盐析，5)结晶等步骤，其特点是树脂：500g724树脂用氢氧化钠溶液50g浸泡1‑2小时，然后用蒸馏水冲洗至pH14；再用pH6.5的磷酸盐缓冲液浸泡8小时；聚丙烯酸：用少许磷酸盐缓冲液溶解分析纯为38％的聚丙烯酸；选择土陶罐、陶瓷或搪瓷容器。本发明将鸡蛋清直接应用于实际生产，生产的溶菌酶晶体具有质量稳定、感观良好、酶活性较高，且晶体产量高，在提高经济效益的同时还降低了生产成本。具检验测定，本发明生产的溶菌酶晶体活力达到68.81lu/mg，是现有技术生产出来的溶菌酶活力20lu/mg的3倍多。
- 高原特种养殖珍禽蛋蛋清溶菌酶的制备方法-201810052257.X
- 冯全忠;邓玉林;孟薇薇;李月海;曲淑华;索文敏;戴荣继;陈艳;孟世英;胡志成;孙俐丽 - 青海华杰实业有限公司;北京理工亘元科技有限公司
- 2018-01-18 - 2018-08-14 - C12N9/36
- 本发明提供了一种高原特种养殖珍禽蛋蛋清溶菌酶的制备方法，涉及生物提取技术领域。上述高原特种养殖珍禽蛋蛋清溶菌酶的制备方法通过将pH为5～7的蛋清加工液加入Na+弱酸性阳离子交换树脂进行吸附处理，并与超滤法相结合进行浓缩除盐，对蛋清中的溶菌酶进行提取。该方法制得的溶菌酶，其成品酶比活大于30000U/mg，纯度大于98％，成品得率大于4‰(蛋清质量)，同时该方法具有提取工艺稳定，可重复性好的优点，有效缓解了现有制备方法提取工艺不稳定以及溶菌酶纯度低、酶活力低等问题。
- 一种新型内溶素多肽-201680060390.9
- M·J·勒斯纳;F·艾兴泽埃尔 - 迈克瑞欧斯人体健康有限公司
- 2016-09-12 - 2018-06-08 - C12N9/36
- 本发明涉及医学领域，具体涉及与葡萄球菌感染相关的病症的治疗领域。本发明涉及特异性靶向细菌葡萄球菌细胞的新型内溶素多肽。本发明进一步涉及所述内溶素多肽用于医学用途，优选用于治疗患有与葡萄球菌感染相关病症的个体。
- 专利分类
