[发明专利]用于肺炎的微生物核酸检测试剂盒及其使用方法

摘要

本发明提供了一种用于在一个样本中检测多个目标核酸序列的方法和装置，其包括在扩增反应物中提供具有不同已知浓度的一个或多个内部定量标准核酸，进行多重PCR扩增反应，其中所述一个或多个内部定量标准核酸的第二阶段扩增反应在不同反应容器内进行，根据在所述不同反应容器测得的每个所述定量标准核酸生成标准曲线，以对靶核酸进行定量分析或半定量分析。本发明还提供了所述方法用于检测多种肺炎相关致病微生物的应用和试剂盒。

主权项

1.一种用于检测样本中多个肺炎相关致病微生物的靶核酸序列的方法的试剂盒，所述检测方法包括以下步骤：(a)向含有样本的循环扩增反应混合物中提供针对多个靶核酸的第一扩增引物组，其包括以各个靶核酸为模板的扩增引物对，每个引物对包括对应的特异性上游外引物和下游外引物，可扩增得到每个靶核酸的第一扩增子，同时，还向所述含有样本的循环扩增反应混合物提供具有不同已知浓度的一个或多个内部定量标准核酸和针对每个所述具有不同已知浓度的一个或多个内部定量标准核酸的第一定量标准引物对，可扩增得到每个定量标准核酸的第一扩增子，对所述循环扩增反应混合物实施多个循环扩增步骤进行第一阶段扩增反应，其中，所述第一阶段扩增反应在同一个反应容器和同一个反应时间段内进行；(b)将步骤(a)获得的扩增产物混合物分为多个部分，进行第二阶段扩增反应，其中一些部分的扩增产物混合物用于所述多个靶核酸的第二阶段扩增反应，其中向反应混合物中提供针对所述多个靶核酸的第二扩增引物组，其包括每个靶核酸的以其第一扩增子为模板的扩增引物对，每个引物对包括对应的特异性上游内引物和下游内引物，可扩增得到每个靶核酸的第二扩增子，其中另一些部分的扩增产物混合物用于所述具有不同已知浓度的一个或多个内部定量标准核酸的第二阶段扩增反应，包括向反应混合物提供针对每个所述定量标准核酸的以其第一扩增子为模板的第二定量标准引物对，可扩增得到每个定量标准核酸的第二扩增子，其中，每个所述定量标准核酸的第二扩增子具有指定的定量标准Ct，而且其中所述多个内部定量标准核酸的第二阶段扩增反应在不同反应容器内进行，(c)根据在所述不同反应容器测得的每个所述定量标准核酸的第二扩增子的指定定量标准Ct对靶核酸的第二扩增子进行定量分析或半定量分析，所述试剂盒具有外壳，其内包括：第一存储器，其中含有所述多个靶核酸的第一扩增引物组，以及含有所述具有不同已知浓度的一个或多个内部定量标准核酸和针对每个所述内部定量标准核酸的第一定量标准引物对；第一反应容器，其用于进行所述多个靶核酸和所述具有不同已知浓度的一个或多个内部定量标准核酸的第一阶段扩增反应；多个第二储存器，其中分别含有所述针对所述多个靶核酸的第二扩增引物组、针对每个所述具有不同已知浓度的一个或多个内部定量标准核酸的第二定量标准引物对；用于进行第二阶段扩增反应的多个第二反应容器，所述多个第二反应容器中的一个或几个用于存储或接受来自第二储存器的所述一个或多个靶核酸的第二扩增引物组以进行所述多个靶核酸的第二阶段扩增反应，所述多个第二反应容器中的另外几个用于存储或接受来自第二储存器的每个所述定量标准核酸的第二定量标准引物对，每个所述具有不同已知浓度的一个或多个内部定量标准核酸的第二阶段扩增反应在不同第二反应容器内进行；连接所述第一反应容器、第二反应容器、所述第一存储器和所述多个第二存储器的通道，所述通道使得液体可在第一反应容器和第二反应容器和所述储存器之间流动。