[发明专利]一种兔单克隆抗体制备方法

摘要

本发明公开了一种兔单克隆抗体制备方法，包括如下步骤：步骤一，免疫血清制备；步骤二，抗体的亲和纯化；步骤三，质谱；步骤四，抗体可变区基因谱获取；步骤五，单克隆抗体获取；其中在上述的步骤一中，选取具有bas突变以及野生亲本b9的异形家兔，将弗氏完全佐剂皮下多点接种家兔，每隔三天免疫一次，共免疫三次，免疫两周后再同样注射一次，免疫一个月后家兔尾静脉注射NG‑XMT^TM蛋白，用无菌小试管收集免疫家兔血，标记后送准备室，以未免疫鼠血清作对照，以ELISA测定抗体效价，通过使用酶标仪测定OD490光吸收值定量和定性地判断免疫血清的是否为阳性，选取阳性免疫血清；本发明，更加高效快速，具有高亲和力。

主权项

1.一种兔单克隆抗体制备方法，包括如下步骤：步骤一，免疫血清制备；步骤二，抗体的亲和纯化；步骤三，质谱；步骤四，抗体可变区基因谱获取；步骤五，单克隆抗体获取；其特征在于：/n其中在上述的步骤一中，选取具有bas突变以及野生亲本b9的异形家兔，将弗氏完全佐剂皮下多点接种家兔，每隔三天免疫一次，共免疫三次，免疫两周后再同样注射一次，免疫一个月后家兔尾静脉注射NG-XMT^TM蛋白，用无菌小试管收集免疫家兔血，标记后送准备室，以未免疫鼠血清作对照，以ELISA测定抗体效价，通过使用酶标仪测定OD490光吸收值定量和定性地判断免疫血清的是否为阳性，当试验孔和阴性孔的比值大于2.1时，认定为阳性，选取阳性免疫血清；/n其中在上述的步骤二中，将蛋白Asepharose CL-4B填料装柱，用洗脱缓冲液洗3~5个柱床体积洗掉乙醇和杂质，用平衡缓冲液流洗5~10个柱床体积平衡柱，血清样品上柱，均匀上样，可将流出液反复上样，用平衡缓冲液再洗5~10个柱床体积，直至基线趋于平缓，分别以相对快速和慢速加入洗脱缓冲液，pH降至约3.0，抗体从填料上洗脱下来，立即用上述中和缓冲液中和洗脱液至pH为中性，防止洗脱缓冲液的酸性环境引起抗体失活，得到样品；/n其中在上述的步骤三中，打开LC-ESI-MS/MS质谱仪，采用纳米流动液相色谱对待测的样品进行分离纯化，分离后的样品进入质谱仪，与串联质谱联用分析被消化的抗体组分；/n其中在上述的步骤四中，通过搜索免疫家兔B细胞免疫球蛋白库的下一代DNA序列建立的参考数据库，获得抗体可变区的高置信度肽谱匹配；/n其中在上述的步骤五中，从抗体可变区基因谱中选取CDR3序列及对应的重链和轻链抗体核酸序列作为候选配对序列，分别构建重链和轻链表达载体，混合配对后利用合适的细胞转染技术和表达系统进行抗体表达，对表达产物进行活性检测，得到阳性组合，将阳性组合中的重链和轻链进行拆分，按照1条重链与1条轻链的原则配对，利用合适的细胞转染技术和表达系统进行抗体表达，对表达产物进行活性检测，得到的阳性组合即为与目的抗原具有高亲和力的单克隆抗体。/n