[发明专利]在DNA分子的环化中仅选择由单分子形成的环化DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及具有能够辨别由单个DNA分子形成的环状DNA、由多个DNA分子形成的环状DNA以及来自于多分子环状DNA的环状DNA的结构的环状DNA分子的制作方法，仅选择由单个DNA分子形成的环状DNA的方法，所述方法中使用的新型衔接头以及包含该新型衔接头的环状DNA制作用试剂盒。并且，本发明涉及使用通过上述方法所得的环状DNA鉴定和/或检测基因的方法。特别涉及鉴定和/或检测引起各种病症的融合基因的方法。

背景技术

作为现有的基因分析方法，可举出载体法。载体法中，将分析对象基因引入到载体中，利用测序仪确定扩增而得的基因的全长序列。但是，载体法存在需要培养操作这样的问题，并且需要用测序仪分析基因的全长。

近年来，已开发出基因分析中的高速测序仪，随之而来作为基因分析手段的配对法备受注目。

图1示意性地显示利用配对法的基因分析的概况。配对法中，使分析对象基因的两个末端与结合用碱基序列(限制性内切酶识别位点)结合，将对象基因环化。然后，以限制性内切酶识别位点为中心，通常使用II型限制性内切酶，从该识别部位开始以前后的15个碱基以上、优选25个碱基以上到数十个碱基以下切下被环化的基因，将其用PCR进行扩增，然后确定被切下的部分基因的碱基序列。由此，当确定对象基因的两个末端的序列时，则可利用已知的序列数据来鉴定基因。配对是指解读一条DNA片段的两端而得的碱基序列的1组序列数据。

作为切下一定碱基数的基因的方法，实际使用下述两种方法：使用II型限制性内切酶剪切离开识别部位的部位而切下规定的碱基数的方法；用超声(Sonication)等对环状DNA进行物理切割并用附在接头的生物素回收，用PCR将该片段扩增后确定序列的方法。

即，配对法中，通过读取使DNA的两个末端结合而环化的基因中结合部分的前后的一定碱基序列，能够鉴定已知的基因。基本上如果读取基因的头部分和尾部分的部分碱基序列，则该序列在各个基因中能够被可靠地区分，配对法作为可靠且简单的基因分析方法被采用(非专利文献1和2)。另外，配对法被应用于下一代的序列分析，随着高速测序仪的出现，变得越来越重要。

但是，为了提供给利用配对法进行的基因分析而使DNA环化的情况下，除单个基因、DNA(单分子)自身环化以外，还会发生多个DNA(多分子)的环化及多分子(2分子以上)的线性结合。多分子所致的线性分子可以通过其后的操作与环状分子分离而被除去，但由多分子形成的环状分子无法与由单分子形成的环状分子分离，成为杂质。基于下述记载的理由，多分子环状物阻碍各个基因分析，使分析特异性大幅度降低。具体而言，如图2所示，使3种cDNA自环化时，如(B)所示，在仅单分子DNA环化的情况下，利用配对法根据正确的序列能够鉴定基因。但是，除如(B)所示发生单分子的环化之外，如(C)所示还会产生未环化的线性cDNA、如(D)所示2个或2个以上的cDNA的环化。(C)情况下可以利用DNA核酸外切酶进行排除，但像(D)这样多个cDNA环化而成的产物被识别为环化分子，无法排除，成为配对法基因分析中的杂质。

配对法中的基因分析是利用对象基因的两个末端碱基序列来鉴定基因。具体而言，在各个基因的两个末端结合用于环化的结合用衔接头，将基因在两个衔接头部位结合环化后，按照以衔接头部位为中心成为一定数目的碱基序列的方式进行切割，其结果通过分析来自于原始基因的各末端的一部分的碱基序列来鉴定基因。因此，对于由多分子形成的环化物而言，衔接头部位有多个，与衔接头结合的两端分别成为不同基因的一个末端。在基因分析时，如上所述，利用上述2个方法中的任一个方法，按照以衔接头为中心结合的两端成为一定数目的碱基序列的方式切割环化物进行基因分析。因此，从由多分子形成的环化物所得的分析用的基因片段包含不同基因的各自一个末端，不能进行单个基因的分析。这样，在利用配对法的基因分析中，由多分子形成的环化物的存在阻碍各基因分析。

多个DNA分子环化的概率通常为百分之几到百分之十几，根据方法而存在差异，但在已知的基因的分析中，基本可以作为异常的碱基序列被识别，从分析序列中排除。因此，虽然繁琐，但只是精度稍有下降。然而，将配对法用于从正常基因组中检测融合基因这种异常基因的存在时，多个正常基因环化的情况下，就会被判断为存在异常基因。其结果，无法正确地确定融合基因等异常基因的存在。

融合基因是指多个(2个)基因结合而构筑成的新功能基因的物质。例如癌细胞中，发现缺失、重叠、重组、易位之类的染色体结构的异常。在DNA水平上发生基因的断裂和连接，如果在各切割点存在结构基因，则会形成融合基因。