[发明专利]一种重组人尿激酶原的病毒去除方法在审
申请号: | 201510919362.5 | 申请日: | 2015-12-11 |
公开(公告)号: | CN106867983A | 公开(公告)日: | 2017-06-20 |
发明(设计)人: | 李雪峰;赵国焓;韩进 | 申请(专利权)人: | 上海天士力药业有限公司 |
主分类号: | C12N9/72 | 分类号: | C12N9/72 |
代理公司: | 北京华科联合专利事务所(普通合伙)11130 | 代理人: | 王为 |
地址: | 201203 上海市浦*** | 国省代码: | 上海;31 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 重组 尿激酶 病毒 去除 方法 | ||
技术领域
本发明属于医药领域,尤其是涉及一种重组人尿激酶原的病毒去除方法。
背景技术
尿激酶原是尿激酶的前体,是一种糖蛋白,由411个氨基酸组成,其本身无活性,经纤维蛋白溶解酶和激肽酶的激活,使其Lys158-Ile159之间的肽链打开形成尿激酶,才能发挥其溶血栓的效能。是一种特异性的溶血栓的药物。
上海天士力生产的重组人尿激酶原为通过基因工程方法构建的中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)表达获得的,主要用于急性ST段抬高性心肌梗死的溶栓治疗,已于2011年作为国家一类新药成功上市。
国家食品药品监督管理局药品审评中心制定的《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》(简称原则)规定,凡是用细胞表达的人用生物制品均要求对生产用细胞株、细胞培养液、产品原液和产品进行病毒检测,并要求纯化工艺中有灭活或除去病毒的步骤,以确保产品不被病毒污染及用药安全。
近年来,国内外多家实验室相继证实,离子交换层析,特别是阴离子交换层析(Anion-exchange chromatography,AEX)在纯化蛋白质的同时,具有稳定可靠的去病毒作用。阴离子交换层析对包括DNA、RNA病毒,有脂包膜和无脂包膜病毒等指示性病毒的去除效率均在99.99%(即4log10)以上。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种有效去除重组人尿激酶原病毒的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的:本发明以重组人尿激酶原发酵液为起始原料,对其进行纯化并取病毒处理,为此本发明提供一种重组人尿激酶原的病毒去除方法,所述方法包括用离子交换层析柱对重组人尿激酶原进行纯化的步骤。
本发明所述方法,还包括将重组人尿激酶原发酵液通过层析后获得的初步纯化液的步骤;
本发明所述进行离子交换层析,可以使病毒例如DNA、RNA病毒、有脂包膜和无脂包膜病毒牢固吸附在离子交换介质上,而重组人尿激酶原直接被洗脱下来,从而达到去除病毒的目的。
本发明所述的离子交换层析包括阴离子交换层析或阳离子交换层析或其结合。
本发明所述将重组人尿激酶原发酵液通过层析后获得的初步纯化液的步骤;是将重组人尿激酶原发酵液经过层析方法得到初步纯化液≥95.0%;
本发明所述用离子交换层析柱对重组人尿激酶原进行纯化的步骤,共有三种技术方案,目的在于去除病毒:
第一种技术方案,方法如下:初步纯化液与Tris-HCl缓冲液混合,调节pH值后上样,病毒被吸附在阴离子交换层析柱上,尿激酶原被Tris-HCl缓冲液洗脱直接穿透,根据UV 280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰,即得纯化后的重组人尿激酶原原液。
优选的,本发明所述的用离子交换层析柱对重组人尿激酶原进行纯化的步骤,方法如下:初步纯化液与0.02~0.035mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0±0.5)按1:1.5~3(优选1:2)体积比混合,调节pH值至8.0±0.5后阴离子交换柱上样,用0.015~0.025mol/L Tris-HCl缓冲液洗脱直接穿透,根据UV 280紫外吸收曲线收集穿透液中的蛋白峰,即为纯化后的尿激酶原。
本发明用离子交换层析柱对重组人尿激酶原进行纯化的步骤中,所述的阴离子填料包括但不限于Streamline DEAE、DEAE Sephacel DE-52,优选Streamline DEAE阴离子填料。所述的Tris-HCl缓冲液为含盐或不含盐的Tris-HCl缓冲液,优选pH8.0±0.5含0~0.20mol/L NaCl,进一步优选初步纯化液与不含盐Tris-HCl缓冲液混合。
为了更好的除去病毒,优选先用Tris-HCl含盐缓冲液平衡层析柱后再上样洗脱,平衡时Tris-HCl缓冲液含盐浓度高于洗脱时Tris-HCl缓冲液含盐浓度。优选平衡时Tris-HCl缓冲液液pH8.0±0.5含0.05~0.20mol/L NaCl,洗脱时Tris-HCl洗脱缓冲液(pH8.0±0.5含0.05~0.15mol/L NaCl)。
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