[发明专利]一种Vero细胞的复苏方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术应用领域，具体地，涉及一种Vero细胞的复苏方法。

背景技术

细胞培养是生物与健康相关研究领域的一项重要技术。随着生命科学的迅速发展，目前细胞培养已成为细胞生物学、分子生物学、遗传学和免疫学等学科研究的重要基础。为了深入探讨细胞的生长活动规律、有关疾病的病理和药物的药理（毒理）机制，开发具有不同针对性的细胞培养方法具有重要意义。细胞复苏是培养细胞的一种，是生命及再生医学领域中广泛应用的关键技术，在研究中往往需要对冻存的细胞进行复苏，从而进行体内外的相关研究。

Vero细胞是日本学者1962年从非洲绿猴(cercopithecus aethiops monkey)肾建立的猴肾细胞系。其名称的由来是取自世界语中“绿”字的VERDE前两个字母和“肾”字前两个字母合在一起，但世界语中不允许VERE存在，而需以“O”结尾，故命名为“Vero”。其第93代被带到美国NIH的过敏与传染病研究所热带病毒研究室，第113代被提交给ATCC，编号为ATCC NO.CCL-81。

除了常规的科研需要之外，经过全面的研究鉴定，Vero细胞具有胞核学稳定，没有外源因子污染和致瘤性的优点，完全符合1987年WHO关于用于生物制品的传代细胞的规程要求，并已被WHO批准可用作疫苗生产的基质。于是，Vero细胞小儿麻痹灭活疫苗、小儿麻痹活疫苗、Vero细胞狂犬病疫苗相继在法国被研制出来并获批准生产。因此，Vero细胞的应用前景以及需求量极大。

发明内容

发明目的：本发明提供了一种Vero细胞的复苏方法。

技术方案：本发明提供了一种Vero细胞的复苏方法，包括以下步骤：将冻存的Vero细胞冻存管从液氮或者-80℃冰箱中取出，在取出后1min内于37℃摇晃至含有Vero细胞专用冻存液的Vero细胞液完全融化将Vero细胞液加入到盛有2-3ml新鲜Vero细胞专用培养基的离心管中，用移液枪上下吹打20-30次，于1000-1500g/min的转速下离心3-10min；移去上清液，加入1-2ml的新鲜Vero细胞专用培养基，用移液枪上下吹打40-50次，然后均匀的加入到盛有7-9ml的新鲜Vero细胞专用培养基，于37℃，5%CO₂培养箱中培养；所述Vero细胞专用冻存液以重量组分计，包括以下组分：二甲基亚砜5-15份、羟乙基淀粉3-8份、葡萄糖5-15份、维生素E1-5份、20%甘露醇2-10份、丙二醇1-2份、(S)-(-)-1-(4-氟异喹啉-5-基）磺酰基-2-甲基-1,4-二氮环庚烷0.8-2份和基础培养基80-90份。本发明所述的Vero细胞的复苏方法，方法合理，能够去除冻存剂对复苏后细胞生长的影响，复苏后的Vero细胞存活率高，细胞生长速度快，细胞状态好，边界清晰，可以有利于乳腺癌转移的相关研究。其中，Vero细胞专用冻存液对细胞损伤小，20%甘露醇为渗透性保护液，而(S)-(-)-1-(4-氟异喹啉-5-基)磺酰基-2-甲基-1,4-二氮环庚烷则抑制细胞活动和基因表达，维生素E的抗氧化性好，在保证休眠Vero细胞的营养的同时还可以显著减少对细胞的损伤，提高冻存细胞的存活率，并且在增殖方面也保持很好的状态。

进一步的，上述的Vero细胞的复苏方法，所述Vero细胞专用培养基包括70-90%的基础培养基以及10-30%的胎牛血清。Vero细胞专用培养基，组分合理，可以进一步为复苏的细胞的提供营养物质。

进一步的，上述的Vero细胞的复苏方法，所述基础培养基以重量组分计，包括以下组分：葡萄糖 80-90份、碳酸氢钠 10-20份、丙酮酸钠8-18份、人血白蛋白2-10份、氯化钾 30-50份、无水硫酸镁 5-12份、氯化钠60-80份、无水磷酸二氢钠 8-16份、PHA-植物血球凝集素0.2-1份、叶酸 0.2-0.6份、肌醇0.5-1.5份、烟酰胺0.2-0.8份、无水氯化钙20-40份、硝酸铁0.1-0.5份、丁二酸 5-10份、丁二酸钠9-18份、D-泛酸钙 0.2-0.8份、酒石酸胆碱0.5-1份、核黄素0.1-0.3份、盐酸硫胺0.1-0.5份、盐酸吡哆辛 0.1-0.6份、还原谷胱甘肽 0.1-0.8份、胆固醇1-5份、抗坏血酸磷酸酯0.5-1.2份、聚碳酸酯0.3-1.5份、酚红钠0.8-1.5份和去离子水100份。