[发明专利]一种凡纳滨对虾comp60701微卫星标记候选序列的筛选方法

说明书

本发明公开的是一种凡纳滨对虾comp60701微卫星标记候选序列的筛选方法，包括以下步骤：（1）筛选候选序列（2）筛选候选微卫星位点（3）设计特异性引物。本发明在没有已知的凡纳滨对虾全基因组DNA微卫星多态性位点的信息下，通过转录组混合样测序，构建转录序列，利用生物信息学分析筛选comp60701微卫星标记多态性位点；为凡纳滨对虾comp60701微卫星标记多态性筛选及检测打下基本，在此基本上可采用软件primer 3设计特异性引物，不仅可便捷的通过聚丙酰胺凝胶电泳完成凡纳滨对虾comp60701微卫星标记多态性检测、验证及基因分型，而且筛选检测费用低、操作简便快速。

技术领域

本发明属于凡纳滨对虾DNA分子遗传标记技术，涉及的是一种凡纳滨对虾comp60701微卫星标记候选序列的筛选方法。

背景技术

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)，俗称南美白对虾；因其全身不具斑纹，步足常呈白垩状，又称白肢虾，其原产于中南美洲，野生种群广泛分布于墨西哥到智利的太平洋等沿岸海域，凡纳滨对虾的人工养殖始于上世纪70年代，我国则在80年代末期引种开展人工繁育研究。因其对白斑病毒(WSSV)具有较好的抵抗力，所以2000年后我国的凡纳滨对虾产量呈爆发式增长，在2016年我国的养殖总产量已达93万吨，占对虾养殖总产量的73％以上，是我国最重要对虾养殖品种。伴随着对虾养殖产业的发展，不仅对种苗的需求逐年提高，而且由于养殖产业的高风险，对于种苗的经济性状的要求也逐年提升，生长快，抗逆优良的品种最受养殖户青睐。然而，现阶段我国的凡纳滨对虾苗种市场长期被国外进口的优良种苗占领。开展凡纳滨对虾的遗传改良和品种选育，开发自主知识产权的品种迫在眉睫。目前我国凡纳滨对虾的遗传选育还是以传统选育为主，采用家系选育策略，结合家系内个体选择开展性状改良工作，其改良周期需累积多个选育世代。为了弥补传统选育成本高，耗时长，工作量大的缺点，研究人员提出采用分子标记辅助育种，全基因选择育种等技术提高凡纳滨对虾性状选育效率。然而，由于凡纳滨对虾全基因DNA信息尚未完成公开发布，与大西洋鲑鱼等海水养殖鱼类相比，目前凡纳滨对虾分子标记开发的数量和质量还不能满足其分子育种的需求。Jerry等人曾开展过斑节对虾(Penaeus monodon)谱系鉴定工作，因为微卫星标记扩增效率、无效等位基因和影子带等因素导致从23对微卫星标记中仅筛选出7对标记(30％)用于系谱鉴定。可见筛选足够数量微卫星DNA分子标记是对虾开展种质鉴定的前提保障。而筛选凡纳滨对虾微卫星DNA分子标记的前提条件是筛选候选序列，筛选出候选序列才能进行凡纳滨对虾微卫星DNA分子标记。本发明提供一种凡纳滨对虾微卫星标记候选序列的筛选方法，使得在凡纳滨对虾基因组DNA信息匮乏背景下的也能快速筛选comp60701微卫星标记多态性位点，可方便、快捷的通过聚丙酰胺凝胶电泳进行斑节对虾微卫星多态性标记验证及基因分型，有利于凡纳滨对虾系谱鉴定、遗传连锁图谱构建等研究开展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种凡纳滨对虾comp60701微卫星标记候选序列的筛选方法，使得在凡纳滨对虾基因组DNA信息匮乏的背景下，也能快速筛选凡纳滨对虾微卫星标记多态性位点，克服现有公知条件下缺乏凡纳滨对虾微卫星标记候选序列，而不能进行凡纳滨对虾微卫星DNA分子标记的不足。

为实现上述目的，本发明采取了下述技术方案，一种凡纳滨对虾comp60701微卫星标记候选序列的筛选方法，包括下述具体技术步骤：

(1)筛选候选序列：提取15个凡纳滨对虾个体的头胸甲总RNA，混合样品进行转录组测序，拼接凡纳滨对虾头胸甲参考转录本，使用软件SciRoKo 3.4检索转录本，检索出含有微卫星序列的unigenes，并筛选微卫星核心序列重复次数超过6次的位点为候选序列；

(2)筛选候选微卫星位点：

其候选comp60701的基因序列为：