[发明专利]构建RRBS文库的Y型接头、试剂盒及方法

说明书

本发明提供了一种构建RRBS文库的Y型接头、试剂盒及方法。该Y型接头包括：甲基化接头1：5'‑acactctttccctacacgacgctcttccgatctn1‑3'；甲基化接头2：5'‑n2n1’agatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac‑3'；其中，甲基化接头1和甲基化接头2退火形成Y型接头，甲基化接头1和甲基化接头2中的碱基c均为甲基化修饰的c，n1和n1’为互补配对的保护碱基序列，n1或n1’的碱基数目为6～12个，n2为酶切位点粘性末端碱基，n2的碱基数目为1～5个。该接头有助于提高测序数据产出，同时提高酶切效率的评估及其准确性。

技术领域

本发明涉及分子育种领域，具体而言，涉及一种构建RRBS文库的Y型接头、试剂盒及方法。

背景技术

RRBS(Reduced representation bisulfite sequencing)，即简并代表性亚硫酸氢盐测序技术，是一种用于基因组单核苷酸级别的甲基化水平分析的高效的高通量测序技术。其原理即利用限制性内切酶MspI与片段选择相结合的方式富集基因组中高GC区域，再通过亚硫酸氢盐测序方法，得到基因组单核苷酸级别的甲基化水平分析结果。

目前的建库方案由以下几个步骤组成：酶切---纯化---末端修复加A尾---连接接头---CT转化---回收目的片段。然而，现有的方法所构建的文库获得测序数据后，通过生物信息学对酶切效率进行评估时，往往出现评估结果偏低的状况。对于此种状况，现有技术中尚无有效的解决方案。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种构建RRBS文库的Y型接头、试剂盒及方法，以解决现有技术中酶切效率评估结果偏低的缺陷。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种用于甲基化文库构建的Y型接头，该Y型接头包括：

甲基化接头1：5'-acactctttccctacacgacgctcttccgatctn1-3'；

甲基化接头2：5'-n2n1’agatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac-3'；

其中，甲基化接头1和甲基化接头2退火形成Y型接头，甲基化接头1和甲基化接头2中的碱基c均为甲基化修饰的c，n1和n1’为互补配对的保护碱基序列，n1或n1’的碱基数目为6～12个，n2为酶切位点粘性末端碱基，n2的碱基数目为1～5个。

进一步地，保护碱基序列为6～8个随机碱基形成的序列。

进一步地，n2的碱基数目为2～4个。

进一步地，酶切位点粘性末端碱基为MspI、BglII、XmaI或TaqI酶切产生的末端碱基。

进一步地，

甲基化接头1为：5'-acactctttccctacacgacgctcttccgatctatgcag-3'；

甲基化接头2为：5'-cgctgcatagatcggaagagcacacgtctgaactccagtcac-3',

其中，甲基化接头1和甲基化接头2中的碱基c均为甲基化修饰的c。

为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种构建RRBS文库的方法，该方法包括：采用内切酶及上述任一种Y型接头，对待测基因组DNA进行边酶切边连接接头，得到带接头片段；对带接头片段进行片段长度选择，得到目标长度片段；对目标长度片段进行CT转化，得到转化片段；对转化片段进行PCR扩增，得到RRBS文库。