[发明专利]利用液相色谱纯化淀粉酶的方法

权利要求书

1.利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，其特征在于：

包括以下步骤：

（1）粗淀粉酶的制备：准备枯草芽孢杆菌，进行发酵得到发酵液，接着将发酵液进行离心，取上清液，得到粗淀粉酶溶液；步骤（1）中发酵的pH值为7.0；步骤（1）中发酵的pH值为7.0的具体调节步骤如下：

101、每隔20min使用针管纵向等距离提取至少三个位置上的提取液，使用pH检测试纸分别检测采集位置的pH值，设定为，其中n为提取的总数最大值，为i高度上采集的提取液的pH值；

102、计算溶液中各个纵向位置上的氢离子浓度，，其中为i高度上采集的提取液的氢离子浓度，同时提取各个高度上的容器的直径大小设为，其中为i高度上容器的直径，计算容器中整体的氢离子浓度，，其中h为容器中溶液的高度；

103、将计算容器中整体的氢离子浓度代入pH值计算公式中，计算整体溶液的pH值；

104、根据计算整体溶液的pH值计算添加的酸碱中和剂的含量，以准确添加酸碱中和剂；

所述103中的pH值计算公式适配为：；

所述104中计算添加的酸碱中和剂的含量的具体步骤为：

1041、采集添加的酸碱中和剂的pH值，设为；

1042、求出酸碱中和剂的需要添加量；

所述枯草芽孢杆菌的分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，保藏编号为CGMCC NO.16139，保藏日期为2018年7月20日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

（2）粗淀粉酶的纯化：将步骤（1）得到的粗淀粉酶溶液，先选择凝胶过滤，接着施加到色谱柱进行洗脱分离，即得到纯化后的淀粉酶溶液，然后烘干；步骤（2）中凝胶过滤的缓冲液为PBS缓冲液；

步骤（2）中凝胶过滤的凝胶材质，以重量份计，包括以下组分：

葡聚糖              150份-200份，

壳聚糖               80份-120份，

β-磷酸三钙           20份-60份，

环氧氯丙烷           0.5份-1.5份。

2.根据权利要求1所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，其特征在于：

步骤（1）中发酵采用的培养基为NB营养肉汤；

所述NB营养肉汤中添加氯化钙，其中氯化钙的终浓度为0.1mM。

3.根据权利要求1所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，其特征在于：

步骤（1）中发酵的时间为24h；

步骤（1）中发酵的温度为35℃；

步骤（1）中发酵的摇床转速为120rm。

4.根据权利要求1所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，其特征在于：

步骤（1）中离心的转速为12000rpm；

步骤（1）中离心的时间为15min；

步骤（1）中离心的温度为4℃。

5.根据权利要求4所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，其特征在于：

步骤（2）中所述凝胶材质的制备方法如下：

将葡聚糖、壳聚糖、β-磷酸三钙、环氧氯丙烷，利用超声处理2min，升温至45℃，然后静置混合孵育72h。

6.根据权利要求1所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，其特征在于：

步骤（2）中洗脱分离的色谱柱为052962型离子交换色谱柱。

7.根据权利要求1所述的利用液相色谱纯化淀粉酶的方法，其特征在于：

步骤（2）中洗脱分离采用的预平衡液为20mM的磷酸钠缓冲液。