[发明专利]一种N‑糖链固相富集并质谱分析的方法

摘要

本发明属糖蛋白质组学和糖组学分析领域，涉及一种用氨基磷酸盐衍生N‑糖链并用Ti4+修饰磁性纳米材料富集衍生后的N‑糖链的方法，其包括首先通过对N‑糖链的还原端进行氨基磷酸盐的衍生在N‑糖链上引入磷酸根，再将Ti4+修饰的磁性纳米材料Fe3O4@Ti4+置于衍生后的糖链溶液中，通过Ti4+和糖链中的磷酸根之间的螯合反应，将糖链固定在磁性纳米材料上，随后将未和纳米材料结合的非糖链分子(如蛋白质、多肽、无机盐等)清洗除去，最后再在碱性条件下将捕获的糖链从材料上解离下来，送入质谱分析糖链。本发明方法步骤简单、操作方便、快速高效，能实现N‑糖链的高灵敏、高选择性质谱分析。

主权项

一种N‑糖链固相富集并质谱分析的方法，其特征在于，采用氨基磷酸盐对N‑糖链的还原端进行衍生，再采用Ti4+修饰的磁性纳米材料Fe3O4@Ti4+为吸附剂对衍生后的N‑糖链进行吸附，实现N‑糖链的选择性富集；其包括步骤：(1)对蛋白质样品进行PNGase F去糖基化处理，使糖蛋白质上的糖链释放；所述的蛋白质样品浓度为10ng/μL—1000ng/μL，溶于10‑50mM碳酸氢铵缓冲液中，其中，蛋白质样品按照每mg蛋白加入1μL的PNGase F酶；(2)加入碱性磷酸酶，去除蛋白质样品中磷酸化蛋白质上的磷酸根；所述的蛋白质样品按照每mg蛋白加入1μL的碱性磷酸酶；(3)冻干去除溶液后，再加入氨基磷酸盐溶液对糖链的还原末端进行衍生，所加入的氨基磷酸盐终浓度为0.5‑2.5mg/mL；反应溶液为甲醇，反应时间为1‑3小时，反应温度为60‑90摄氏度；(4)冻干去除溶液后，再加入Fe3O4@Ti4+纳米材料及富集溶液，混匀，其中，加入的Fe3O4@Ti4+材料浓度为1mg/mL‑10mg/mL；Fe3O4@Ti4+磁性纳米材料进行样品富集的温度是25‑37摄氏度，样品富集的时间是0.5‑2小时，溶液为50％乙腈水溶液，其中含1‑5％的三氟乙酸TFA；(5)外加磁场，使磁性材料和溶液分离，收集下层固体相；(6)用50μL－1mL 50％乙腈水溶液，其中含1‑5％的三氟乙酸，清洗材料1‑3次，清洗后外加磁场将材料和溶液分开，收集材料；(7)加入氨水溶液，用5‑10μL的5％NH3·H2O溶液混匀材料，将糖链从材料上解离；(8)外加磁场再次将材料从溶液中分离后，取上清液与有机基质混合，进行基质辅助激光解吸离子化质谱分析。