[发明专利]斑马鱼诱导性多能干细胞的诱导方法以及用于该诱导方法的诱导型培养基、iPS培养基

摘要

本发明公开了一种斑马鱼诱导性多能干细胞的诱导方法，包括以下步骤：首先，取斑马鱼组织或斑马鱼胚胎，经过体外分离培养获得斑马鱼成纤维细胞，然后用病毒感染斑马鱼成纤维细胞，再对感染后的斑马鱼成纤维细胞进行诱导，经人工挑克隆及传代培养得到斑马鱼诱导性多能干细胞。基于同一个技术方案，同时还公开了用于该诱导方法的诱导型培养基和iPS培养基。RT‑PCR分析表明，经本发明的胚胎成纤维诱导的iPS细胞具有分化为三胚层来源的各种细胞的潜能。本发明攻克了慢病毒在鱼类细胞中感染效率低的技术难点，为斑马鱼体细胞重编程机制研究提供了新的工具细胞来源以及新的思路来选择细胞材料。

主权项

1.一种斑马鱼诱导性多能干细胞的诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：首先，取斑马鱼组织，经过体外分离培养获得斑马鱼成纤维细胞，然后用病毒感染斑马鱼成纤维细胞，再对感染后的斑马鱼成纤维细胞进行诱导，经人工挑克隆及传代培养得到斑马鱼诱导性多能干细胞；所述诱导是指用含有盐酸强力霉素的诱导型培养基对感染后的斑马鱼成纤维细胞进行诱导；所述传代培养是指用iPS培养基对挑克隆后的诱导性多能干细胞进行传代培养；所述诱导型培养基包括以下成分：90％DMEM、7.5％胎牛血清、2.5％鱼血清、1mM L‑谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、0.1mMβ‑巯基乙醇、1％的青霉素/链霉素和10ng/ml bFGF；所述诱导型培养基中添加有浓度为2～4ug/mL的盐酸强力霉素；所述iPS培养基包括以下成分：90％DMEM、7.5％胎牛血清、2.5％鱼血清、1mM L‑谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸0.1mMβ‑巯基乙醇、1％的青霉素/链霉素、10ng/ml bFGF、0.5μMPD0325901、0.5μM ALK5inhibitor A‑83‑01、3μM GSK3βinhibitor CHIR99021和1000U/ml LIF；所述斑马鱼组织为斑马鱼成体尾鳍；所述用病毒感染斑马鱼成纤维细胞的具体操作包括：将293T细胞接种于含有培养基A的培养皿中，按9μg TetO‑FUW‑OSKM/FUW‑M2rtTA/TetO‑FUW‑GFP、6μg pSPAX2、3μgpMD2.G添加质粒，按照转染操作处理后放置于饱和湿度培养箱中转染，转染至少48h后进行病毒液的收集，病毒液经低温高速浓缩滤器过滤后添加入聚凝胺，然后将含有聚凝胺的病毒液感染斑马鱼成纤维细胞；所述培养基A的成分为90％DMEM、10％胎牛血清、1mM L‑谷氨酰胺、0.1mM非必需氨基酸、0.1mMβ‑巯基乙醇和1％的青霉素/链霉素。