[发明专利]败血症中革兰氏阴性病原菌分离的新方法

摘要

本发明公开了革兰氏阴性病原菌的分离，该方法为革兰氏阴性病原菌后续研究提供基础，涉及生物技术领域。方法包括磁性纳米粒子与链霉亲和素的偶联、刀豆蛋白A与长链生物素的偶联、生物素化的刀豆蛋白A偶联链霉亲和素包被的磁性纳米粒子、链霉亲和素和长链生物素介导的刀豆蛋白A结合磁性纳米粒子复合物捕获样品液中的革兰氏阴性病原菌，在外加磁场的作用下，将捕获的革兰氏阴性病原菌与样品液进行分离，并进行重悬等步骤。磁分离捕获到的革兰氏阴性病原菌可以直接进行后续分析，与传统的细菌磁分离方法相比，该方法可以对食品基质和血液中的革兰氏阴性病原菌进行磁分离，不仅提高了样品中革兰氏阴性病原菌的分离效率，同时也降低了成本。

主权项

革兰氏阴性病原菌的快速分离方法，其特征在于包括以下步骤：(1)吸取2mL的磁性纳米粒子(10mg/mL)，加入到8mL pH＝7.4的无菌的PBS溶液中，然后在外加磁场的作用下，对磁性纳米粒子进行洗涤，重复3次，将洗涤后的磁性纳米粒子重悬于10mL无菌的PBS溶液中；(2)5.8mg EDC，溶于290μL无菌的PBS中，6.5mg NHSS，溶于325μL无菌的PBS中，然后将溶解后的EDC和NHSS加入到洗涤过的磁性纳米粒子溶液中，活化1h；(3)将活化后磁性纳米粒子用无菌的PBS洗涤3次，重悬于8mL无菌的PBS溶液中；(4)称取链酶亲和素0.5mg，溶解到100μL灭菌的PBS溶液中，然后加入到活化后的磁珠溶液中，反应2h，然后用灭菌的PBS洗涤3次，重悬于8mL灭菌的PBS溶液中，加入0.3％BSA封闭45min，然后用灭菌的PBS洗涤3次，重悬于8mL灭菌的PBS溶液中，得到链酶亲和素修饰的磁珠；(5)称取10mg刀豆蛋白A，溶于400μL灭菌的PBS溶液中，1mg长链生物素，溶于100μL灭菌的PBS溶液中，然后将溶解后的长链生物素加入到溶解的刀豆蛋白A中，孵育2h，用30kDa的超滤管在8℃、3000rpm条件下冷冻离心，用10个体积灭菌的PBS不断清洗，得到生物素化的刀豆蛋白A；(6)将生物素化的刀豆蛋白A加入到链酶亲和素修饰的磁珠中，孵育45min；(7)反应完毕后，用无菌的PBS洗涤3次，重悬于10mL无菌的PBS溶液中，得到终浓度为2mg/mL的刀豆蛋白A‑磁性纳米粒子复合物，用于富集革兰氏阴性病原菌；(8)取10mL待测样品溶液，加入1mg刀豆蛋白A‑磁性纳米粒子复合物，置于培养箱上，以200rpm的转速37℃孵育45min；插入磁力架分离6min；(9)磁分离后，无菌PBS溶液清洗后，用无菌的PBS缓冲液重悬即得富集有革兰氏阴性病原菌的革兰氏阴性病原菌‑刀豆蛋白A‑磁性纳米粒子复合物。