[发明专利]一种新型5种抗菌肽串联表达重组工程菌构建方法及其应用在审
| 申请号： | 201910589799.5 | 申请日： | 2019-07-02 |
| 公开（公告）号： | CN110305890A | 公开（公告）日： | 2019-10-08 |
| 发明（设计）人： | 王莲哲;洪军;谢朝晖;柳静;胡建业;刘俊红;时宁;任亚彬;左晓洁 | 申请（专利权）人： | 河南城建学院 |
| 主分类号： | C12N15/81 | 分类号： | C12N15/81;C12P21/02;C07K7/08;C07K14/00;C12R1/84 |
| 代理公司： | 西安研创天下知识产权代理事务所(普通合伙) 61239 | 代理人： | 郭璐 |
| 地址： | 467000 *** | 国省代码： | 河南;41 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种新型5种抗菌肽串联表达重组工程菌构建方法及其应用，通过将5种不同的广谱抗菌肽串联，中间插入甲酸切割位点，构建到酵母分泌性表达载体pPIC9k中，并经酶切线性化后转化毕赤酵母感受态细胞获得。重组工程菌插入氨基酸序列特点，所有氨基酸用毕赤酵母偏好性密码子进行替换，以保证在毕赤酵母中的最优表达。插入序列为5种不同的广谱抗菌肽串联表达，中间插入甲酸切割位点。本发明根据毕赤酵母的密码子偏爱性对5种新型抗菌肽进行优化并串连，然后构建真核重组表达载体，达到5种不同抗菌肽在毕赤酵母中的串联表达，提高发酵产物的表达量及活性。 | ||
| 搜索关键词： | 毕赤酵母 串联表达 构建 重组工程菌 抗菌肽 广谱抗菌 切割位点 甲酸 毕赤酵母感受态细胞 表达载体pPIC9k 密码子偏爱性 偏好性密码子 重组表达载体 氨基酸序列 新型抗菌肽 发酵产物 酵母分泌 表达量 并串连 线性化 氨基酸 酶切 真核 替换 应用 串联 转化 优化 保证 | ||
【主权项】：
1.一种新型5种抗菌肽串联表达重组工程菌构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1.串联表达抗菌肽基因序列设计通过文献查阅法筛选到5个广谱高效低毒的抗菌肽，抗菌肽数据库编号分别为AP02901，AP02785，AP02847，AP02786，AP02898；根据抗菌肽的氨基酸序列，利用毕赤酵母偏爱性密码优化其核苷酸序列，不同抗菌肽之间以甲酸切割位点分割，5个抗菌肽进行序列串联，最后首尾两端分别加入酶切位点，串联表达设计顺序为EcoR I+ATG+kex2+抗菌肽AP02901+甲酸切割位点+抗菌肽AP02785+甲酸切割位点+抗菌肽AP02847+甲酸切割位点+抗菌肽AP02786+甲酸切割位点+抗菌肽AP02898+甲酸切割位点+终止子+Not I，具体序列如SEQ：ID：NO:1所示；翻译的蛋白序列如SEQ：ID：NO:2所示，委托武汉金开瑞生物科技公司进行基因合成；5个抗菌肽单体氨基酸序列分别为：AP02901如SEQ：ID：NO:3所示；AP02785如SEQ：ID：NO:4所示；AP02847如SEQ：ID：NO:5所示；AP02786如SEQ：ID：NO:6所示；AP02898如SEQ：ID：NO:7所示；步骤2.载体构建利用限制性酶切将串联表达框通过酶切位点EcoR I和Not I与毕赤酵母表达载体pPIC9K相连，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，氨苄抗性筛选，结合菌落PCR及测序鉴定重组表达载体；步骤3.酵母转化线性化重组质粒电击法转化进毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布MD平板筛选，30℃培养2‑3天；步骤4.转化子筛选鉴定将MD平板上的转化子转接到G418平板上筛选多拷贝子，筛选浓度3mg/ml；挑取筛选后的多拷贝子，通过提取转化子的基因组进行PCR反应，筛选阳性菌；得到表达串联重组抗菌肽的基因工程菌；步骤5.串联重组抗菌肽的诱导表达及高效表达工程菌的筛选挑选将经过G418筛选及PCR鉴定的重组菌20个，分别用1‑20号进行编号；于25mL BMGY液体培养基中，30℃、220r/min培养18h；将培养液置于预先灭菌的离心管中，6000rpm离心10min，收集沉淀，后转接到100ml BMMY液体培养基中，每24h加一次甲醇，甲醇终浓度为1％，分别在24、48、72、96、120h取样，12000r/min离心2min，取上清液，发酵上清液用考马斯亮蓝法测定蛋白含量，并用Tricine‑SDSPAGE凝胶电泳检测表达蛋白，并通过灰度分析，检测纯化后的串联重组抗菌肽含量，筛选出高效表达工程菌菌株。
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- 2016-01-26 - 2019-07-23 - C12N15/81
- 本发明涉及一种酿酒酵母等位基因高效整合质粒系统及其应用，所述系统包括4种酿酒酵母等位基因整合质粒分别为pDH735、pDH818、pDH824和pDH825。所述系统应用于酿酒酵母的等位基因高效整合，整合方法包括：构建4种基于不同用于酿酒酵母等位基因整合的卡盒的酿酒酵母等位基因整合质粒；将待研究的靶向基因及其侧翼克隆到质粒的整合卡盒中；将整合卡盒释放或扩增出来，转入基因敲除背景或者非基因敲除背景的酿酒酵母菌株中，筛选鉴定整合效果。本发明高效、便捷、高通量、适用范围更广的等位基因整合方法；尤其是适用于酿酒酵母基因组的快速、大通量的等位基因整合。
- 酵母表达载体构建及表达外切型纤维素酶的方法与应用-201910267343.7
- 赵向辉;刘婵娟;瞿明仁;潘珂 - 江西农业大学
- 2019-04-03 - 2019-07-19 - C12N15/81
- 本发明公开了一种酵母表达载体构建及表达外切型纤维素酶的方法与应用，利用现代分子技术成功优化了编码香菇外切型纤维素酶的基因序列，构建了能够在酵母体外表达外切型纤维素酶的表达载体pPICZαA‑Cel7A，利用该载体和毕赤酵母能够制备外切型纤维素酶，进而为外切型纤维素酶在生产中的应用提供技术支撑。通过本发明方法获得的重组毕赤酵母菌酶产率高，活性高，效果佳。
- 一种可降低酿酒酵母乙醇产率的重组质粒pY16TEF1-△SPT15及其应用-201610352024.2
- 秦义;杜青;宋育阳;刘延琳 - 西北农林科技大学
- 2016-05-25 - 2019-07-09 - C12N15/81
- 本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种可降低酿酒酵母乙醇产率的重组质粒pY16TEF1‑△SPT15及其应用。本发明重组质粒pY16TEF1‑△SPT15包括重组质粒pY16TEF1‑△SPT15‑409和重组质粒pY16TEF1‑△SPT15‑619；所述的重组质粒pY16TEF1‑△SPT15‑409中的△SPT15‑409是SPT15基因经过突变后获得，△SPT15‑409碱基序列为SEQ ID No.2，其所翻译的转录因子spt15p的氨基酸序列为SEQ ID No.3；所述的重组质粒pY16TEF1‑△SPT15‑615中的△SPT15‑615是SPT15基因经过突变后获得，△SPT15‑615碱基序列为SEQ ID No.4，其所翻译的转录因子spt15p的氨基酸序列为SEQ ID No.5。本发明能降低酿酒酵母乙醇产率。
- 一种可提高酿酒酵母乙醇产率的重组质粒pY16TEF1-△SPT15-125及其应用-201610351632.1
- 秦义;杜青;宋育阳;刘延琳 - 西北农林科技大学
- 2016-05-25 - 2019-07-09 - C12N15/81
- 本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种可提高酿酒酵母乙醇产率的重组质粒pY16TEF1‑△SPT15‑125及其应用。本发明一种重组质粒pY16TEF1‑△SPT15‑125，所述的重组质粒pY16TEF1‑△SPT15‑125中的△SPT15‑125是SPT15基因经过突变后获得，△SPT15‑125碱基序列为SEQ ID No.2，其所翻译的转录因子spt15p的氨基酸序列为SEQ ID No.3；所述的序列SEQ ID No.2中发生突变的碱基分别为39a>g，128 a>g，156a>g、163a>g、247a>g、653a>g；所述的序列SEQ ID No.3中发生突变的氨基酸分别为Glu43Gly，Lys55Glu,Lys83 Glu,Lys218Arg；所述的携带重组质粒pY16TEF1‑△SPT15‑125的酿酒酵母在提高乙醇产率中的应用。本发明可提高酿酒酵母乙醇产率。
- 一种体外蛋白合成体系、试剂盒及其制备方法-201711452033.X
- 郭敏;徐开;陈鉴冰;周子鉴;柴智;章小铃;王海鹏;于雪 - 康码（上海）生物科技有限公司
- 2017-12-28 - 2019-07-05 - C12N15/81
- 本发明提供了一种体外蛋白合成体系、试剂盒及其制备方法，具体地，本发明由特定比例的(a)细胞提取物；和(b)第一反应促进剂混合所形成的无细胞的体外蛋白合成体系可显著提高外源蛋白的合成效率。
- 一种毕赤酵母中异源表达内切葡聚糖酶EGⅡ，EGⅣ，EGⅤ的构建方法-201910230812.8
- 钟成;舒月力;李栋梁 - 天津科技大学
- 2019-03-26 - 2019-07-05 - C12N15/81
- 本发明的目的在于构建一种异源表达EGⅡ，EGⅣ，EGⅤ蛋白的重组毕赤酵母,具体步骤如：(1)里氏木霉RNA和CDNA的获得:固体诱导培养基获得菌丝体，试剂盒提取总RNA和cDNA；(2)目的基因的克隆:用合理引物PCR扩增出目的基因；(3)构建表达载体:以Ppic9k为载体,将目的基因插入启动子AOX1下游,5'和3'端酶切位点分别为EcoRⅠ，NotⅠ；(4)获取重组菌株:以bglⅠ为表达载体的线性化位点,实现表达载体线性化,电转，得到重组酵母；(5)重组菌株的诱导产酶：摇瓶发酵，用适当甲醇诱导产酶；(6)重组蛋白活性检测：利用SDS‑PAGE及刚果红‑CMC检测重组蛋白的表达量及活性。本方法构建的重组菌株能高效表达带his标签的蛋白，能得到高效单酶组分。
- 用于高通量酵母双杂交技术的重组载体及其大规模筛选互作蛋白的方法-201610436290.3
- 曹罡;杨芳;周美玲;雷莹莹;姚琪利;韩以超;朱成航;伍享;戴金霞;宋云峰;陈西;曾思华;傅振芳 - 华中农业大学
- 2016-06-17 - 2019-07-05 - C12N15/81
- 本发明公开了一种用于酵母双杂交的相关重组载体及其利用高通量测序技术大规模筛选互作蛋白的酵母双杂交的方法，该方法依赖于一种整合酶Integrase phiC31(En)的特有整合功能，通过对传统酵母双杂交载体的改造，使其与高通量测序技术有机结合，实现成百上千的Bait蛋白同时对Prey蛋白文库的筛选工作。将整合酶及其特异识别的核苷酸序列插入Matchmaker GAL4系统的载体中，通过酵母双杂交的方法使重组载体进入同一个酵母细胞，整合酶发生作用，将其特异识别的核苷酸序列及其紧邻的核苷酸序列进行特异性定向重排，从而使得两个重组载体融合成一个融合载体，此时猎物和诱饵蛋白序列被定向连接成融合载体上的一段新的序列，通过扩增、高通量测序，从而经济高效地筛选相互作用蛋白质并构建全面的蛋白互作网络图谱。
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