[发明专利]一种分离纯化嗜铁细菌的方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种分离纯化嗜铁细菌的方法，尤其是一种适应用于从植物根系土壤中的分离纯化嗜铁细菌的方法。

二、背景技术

铁是植物生长发育的必需营养元素之一，地壳中铁元素的含量占第四位，但大部分不能被植物直接吸收利用，土壤中的铁元素一般都是通过嗜铁细菌作用后，再被植物吸收，因此在植物的根系土壤中存活大量的嗜铁细菌是十分必要；而在通气性良好的土壤中，特别是在碱性土壤中，能够被植物吸收利用的有效铁含量非常低，提高土壤中铁的生物有效性是农业生产上的重要课题，现还没有一种方法能够快速分离纯化嗜铁细菌，并再把嗜铁细菌应用在植物的土壤的根系中，从而促进植物生长。

三、发明内容

为了克服上述技术缺点，本发明的目的是提供一种分离纯化嗜铁细菌的方法，使植物的发病率下降，促进了植物的生长，增加了植物的产量。

为达到上述目的，本发明采取的技术方案是：其步骤是：

1、从植物的根系旁边的土壤中取试样，分别放在容器中；

2、把常用细菌液体培养基加入到容器中，通过振荡培养，对土壤的细菌进行富集培养，培养1-2天后；

3、使用平板稀释法，把容器中的土壤细菌分别放置在细菌固体平板上，然后分别进行细菌的分离；

4、在细菌固体平板上涂抹一薄层半固体CAS检测剂；

5、待CAS检测剂显色后，根据嗜铁圈直径与菌落直径的比值即HD/CD值大小初步确定各个菌株嗜铁能力的强弱，从细菌固体平板上选取HD/CD值大于1.5的嗜铁圈的菌落，再分别进行纯化培养，获取纯菌株；

6、使用室内平板对峙试验方法，对获取的纯菌株，进行各种植物病原菌的拮抗作用观察；

7、选取抑制率大于90％的菌株，使用盆钵试验方法，评估不同编号的菌株对相应植物病害的生防效果，再选取生防效果好的菌株。

对植物的田间试验结果表明，使植物的发病率下降了81％，促进了植物的生长，增加了植物的产量，使植物的产量增加率为18％。

四、具体实施方式

本发明的第一个实施例：一种分离纯化嗜铁细菌的方法，其步骤是：

在山东省果树研究所的试验田中，在山东省果树研究所承担的山东省科技攻关桃树育苗课题的试验田中，

1、从桃树苗木的根系旁边的土壤中取20个试样，分别放在编号为1-20的容器中；

2、把经灭菌的LB液体培养基加入到编号为1-20的容器中，通过振荡培养对土壤的细菌进行富集培养，培养1-2天后；

3、使用平板稀释法，把编号为1-20的容器中的土壤细菌分别均匀涂抹在编号为1-20的LB细菌固体平板上，然后分别进行细菌的分离；

4、在编号为1-20的细菌固体平板上涂抹一薄层半固体CAS检测剂，在本实施例中使用了Chrome Azurol Sulphonate，铬天青检测剂；

5、待CAS检测剂显色后，根据嗜铁圈直径与菌落直径的比值即HD/CD值大小初步确定各个菌株嗜铁能力的强弱，从编号为1-20的细菌固体平板上选取HD/CD值大于1.5的嗜铁圈的菌落，再分别进行纯化培养，获取纯菌株；在本实施例中，选取了1-10号、12、14、15、17、18、20号的细菌固体平板；

6、使用室内平板对峙试验方法，对获取不同编号的纯菌株，进行各种植物病原菌的拮抗作用观察；在本实施例中，选取了1-6、7、9、12、14、15、17、18、20号的细菌固体平板；

7、选取抑制率为90％以上的菌株，使用盆钵试验方法，评估不同编号的菌株对相应植物病害的生防效果，再选取生防效果好的菌株，在本实施例中，选取了1-6、7、9、12、15、17、18、20号的细菌固体平板；。

把桃树育苗试验田分为两个区并编号为A区和B区，把选取的菌株再施入在A区的土壤中，在A区和B区中同时进行桃树育苗，经过两年的育苗试验

在本发明的第二个实施例中，选取了泰安市夏张镇李庄的10棵梨树，把10棵梨树中的每5棵设定一组，编号为C组和D组，从10棵梨树中取了50份式样，通过第一个实施例中的第2至第7步骤，最后选取了43份菌株，再把这43份菌株分别施到C组的梨树中，经过一年的试验。