[发明专利]用于分离包括传统培养基中无法培养的如支原体的物种的临床样本的培养基

说明书

详述

本发明涉及用于支原体属微生物的特异性的培养基，并且，具体地，涉及难培养的支原体(生殖支原体、肺炎支原体、透支原体、发酵支原体、梨支原体(Mycoplasma pirium)、猪鼻支原体)。本发明还提供了用于属于支原体属物种的生长和/或分离和/或鉴定的体外方法以及使用这种培养基的生长支持物。

在先技术的状态

支原体是能够自由生活的最小的微生物，它们与病毒不同，可在无细胞的培养基中生长，它们通过二分裂繁殖，因缺乏细胞壁而与细菌不同；然而，它们有三层构成的细胞膜，包括细菌或病毒中均不存在的为结构提供支撑的固醇类物质(1-9)。

如果将它们保持在包括其繁殖所需的全部蛋白质络合物的渗透稳定的培养基中，它们没有细胞壁即可存活。可以在动物有机体中或在细胞培养基或具有高度复杂配方的培养基中发现这种情况。

支原体属(支原体科、支原体目)的细菌属于柔膜细菌(“光滑的皮肤”)类，它们代表一组复杂而精细的微生物，在原核生物中具有独特性，对于微生物学家来说，目前是一谜团。

它们在大自然中普遍存在，目前已知物种的数量正在增加，约为200种，其中许多表现为共生，而其他物种对于人类和动物和植物而言都是致病性的(7-14)。

在人类中分离出14个物种，其中12个属于支原体属和2个物种(变型微小脲原体(Ureaplasma biovar parvum)和解脲脲原体)属于脲原体属。14个物种中的6个主要位于泌尿生殖道(14-21)。

支原体具有3个主要的生物学特征，使得它们不同于其它的细菌，并且表征了其与宿主有机体相关的行为特征。这些特征是：

1-无细胞壁，且已知在自由生活的微生物中尺寸最小，如其细胞大小(0.2-0.8μm)和其基因(genoma)大小。这种生殖支原体具有包含在能够自动复制的细胞中的最小的基因(580kb，且仅381个基因)，其基因含量决定了用于DNA复制和修复以及遗传转录和翻译所必需的基因的最小数量；

2-代谢途径的有限预知。肺炎支原体和生殖支原体的基因组的完整表征证明不存在涉及氨基酸合成的基因并且缺乏用于维生素，核酸、脂肪酸和胆固醇前体生物合成的基因，因此它们完全依赖于他们自己的外源供应，来自宿主生物体的细胞或来自复杂和丰富的培养基，尽管其复杂的组成仅能使得最严苛的支原体物种在2周或更长时间内生长；

3-微生物－宿主相互作用，其表现为与上皮细胞和免疫系统的细胞的表面寄生，并且作为一些物种的兼性形式(保持体外细胞外和细胞内活力的能力)的细胞内定位。

基因组大小及其碱基组成构成支原体的主要性质。与他们自己的大小相比，支原体物种的基因组为从600到2300kb的范围。例如，肺炎支原体具有816kb的基因组，而生殖支原体的基因组甚至更小，因为其为580kb，并且目前在最先进的研究中，倾向于将其用作研究最小基因组的参考，以具有自主活力为目的。

因此可以理解，对于这些药物的复制，强加了复杂的营养需求，因为它们缺乏表征大部分细菌的几种酶学途径，并且它们完全依赖于例如氨基酸、核苷酸、脂肪酸和甾醇类的生物合成前体的外源供应(22-26)。

不同的支原体物种的鉴定和实验室的诊断基于基本的细菌学检验，比如：形态学、菌株特征、生化和生理测试。这些测试的实施需要培养菌株，这对某些物种来说是困难的、复杂的和昂贵的。

人源性支原体的生长只能通过分离具有确定的致病潜力并且在特异的和标准化的培养基(如脲原体、人支原体和肺炎支原体)中生长相当满意的物种来进行。所有的支原体物种需要复杂的培养基，由甾醇类、脂肪酸、氨基酸和满足营养需求的其他化合物构成。其处理需非常小心，并且需要检查其全部和每个组分。因此，很少有临床实验室提供用作支原体感染的诊断方法的培养基。然而，培养基仍然是临床分离(包括抗性研究)的生物学和分子表征的基础。

必须用分子技术(27-30)检测极度刺激性的物种，比如生殖支原体、发酵支原体、透支原体和梨支原体(Mycoplasma pirum)。

在开发用于微生物诊断的分子技术后，目前已经开发了分析基因组DNA、核糖体RNA等方法，尽管它们是昂贵的方法，并且其中一些方法只能在具有精密设备、配有高素质人员的实验室中应用。然而，目前有一些分子技术仅对某些支原体物种的诊断足够有效，而其它物种则由于开发复杂性和高成本还在研究中。

总而言之，已知的现有培养基主要用作支原体菌株增殖和生长的工具。